Добро пожаловать


• Вход  • Регистрация
• Забыли пароль?

Обратная связь

О фирмах

Разделы

Сорбенты

Подскажите хромато-масс-спекторметр для протеомных исследований

Уважаемые коллеги! и особенно уважаемые и мной любимые Василий и Валерий! Подскажите, пожалуйста, какой хромато-масс-спектрометр лучше подобрать для протеомных исследований. По сути поставлена задача преобразования (плавно-постепенного, медленным шагом, робким зигзагом) преобразования биохимической лаборатории и переориентирование на протеомные исследования.  Буду благодарна за любую информацию

Valeriy's picture

Давайте конкретизируем задачку!

Опросный лист - обычная практика!
Давайте попробуем ответить на несколько вопросов:
1) Что хотим определить?
2) Где хотим определить? (хотя "где" я уже приблизительно знаю ;))
3) Какова цель работы, кратко.
4) Может методика есть?

"...Кабы схемку, аль чертеж, мы б затеяли вертеж..." (с)

Вот такую хотите: http://www.ibmc.msk.ru/ru/departments/75?start=4 ...?

Василий's picture

Да, ответы не

Да, ответы не помешают, хотя протеом он и в Африке протеом:) - совокупность всех белков организма (клетки, органа и т.д.). Так что тут различия только в пробоподготовке, т.е. необходим воспроизводимый метод позволяющий выделять белки из образца конкретной ткани с минимальными потерями. Классика жанра, как Вы уже скорее всего знаете, это связка из 2D SDS-ПААГ электрофореза и MALDI TOF (ссылка: http://www.youtube.com/watch?v=gTRsaAnkRVU&feature=related). Также существуют методы на основе 2 мерной хроматографии и опять же MALDI TOF или ESI-MS/MS. Первый случай выгоднее, т.к. пробоподготовка проще и практически для всех образцов подходит стандарный подход, практически исключающий потери, но разделение идет только по заряду (изофокусировка) и размерам. При использовании 2 мерной хроматографии пробоподготовка сложнее (т.к. хроматографическую колонку легче убить, а ее жалко), потери могут быть выше, но зато можно использовать разделение комбинируя несколько методов, например по размерам (гель-эксклюзивная хроматография) и по гидрофобности (гидрофобная хроматография), по заряду (ионообменная хроматография или изофокусировка) и по гидрофобности ит.д. Также преимуществом является то, что белки при жидкостной хроматографии находятся в менее агрессивных условиях, чем при 2D электрофорезе, что позволяет надеяться на сохранение их биологической активности. Также в описываемых системах, зачастую, между хроматографическими разделениями можно проводить дополнительную модификацию образцов для следующего разделения (добавление внутреннего стандарта, дериватизацию, ферментативный гидролиз и т.д.), что иногда позволяет обойтись без масс-спектрометрии для однозначного определения какого-либо белка. Вот, например, ссылка на подход фирмы Dionex в 2 мерной хроматографии: http://www.dionex.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-solutions/... . Принцип следующий: разделение проводится одним способом, при этом элюат собирается по фракциям в автосемпелере (да вот такой автосемплер с возможностью сбора фракций), после чего полученные фракции сами являются образцами для фракционирования другим хроматографическим методом. Предварительно в место для сбора фракций можно раскапать ферментативные преператы, или (и) стандарты и т.д. Но в принципе, если нет такого автосемплера, фракции можно собирать и в ручную с теми же результатами: http://www.dionex.com/en-us/webdocs/110509-PN-LC-TopDownProteomics-Capil... .
Конкретную модель масс-спектрометра без каких-то входящих данных посоветовать сложно. Можно же, например, использовать технологию Proteomics Fingerprinting (ссылка: http://www.youtube.com/watch?v=BL2HvODCg3w&feature=related ), которая основана на получении и последующем сравнении тотального масс-спектра образца с эталонным масс-спектром. Тут нужен один прибор, для возможности проведения анализа in situ. Для более детального изучения протеома (изучения структуры белков) нужно использовать другие методы и приборы.
Да, чуть не забыл:). Естественно кроме всего прочего надо использовать Western blot.
Вообщем, действительно, надо все таки для начала определиться: чего мы хотим. В принципе пептидным картированием вы уже сейчас, с грехом пополам, можете заниматься.

sakurako's picture

Опросный лист

1. Спасибо Вам большое, глубокоуважаемый Валерий!
2. хотим найти белковые маркеры воспалительных заболеваний кишечника, т.е. те белки, которые окажутся специфичными для данных нозологий. ну и попутно неплохо бы изучить весь белковый состав крови при этих болезнях (ну и не только крови и не только при этих). так я мыслю, по крайней мере, а что мыслят вышестоящие инстанции, мне неведомо.
3. где определять - Вы уже примерно знаете, в чем определять - основные биологические жидкости - кровь, моча, фекалии, биоптаты толстого кишечника (а куда деваться, мы же медики!)
4. краткая цель работы: поиск маркеров, специфичных для ВЗК, плюс вклад в формирование картины патогенеза ВЗК на биохимическом, морфологическом, имммунологическом уровне.
5. а какая может быть методика? биохимических полно, а для масс-спектрометра? думать-то мы не хотим, нам бы что-нибудь такое: раз плюнули - и готов анализ.
6. "... кабы нас со здравым смыслом да судьба свела, -
Ох, веселые пошли бы по земле дела!...

sakurako's picture

картирование

Василий, спасибо Вам большое!
вот вопрос про пептидное картирование - а как можно его делать и что нужно для этого? принимая во внимание, что начинаем с нуля?
заранее благодарна

Василий's picture

Пептидное

Пептидное картирование - аналитический метод для подтверждения подлинности белка. Основан на сравнении ВЭЖХ хроматограмм лизатов стандарта и исследуемого белка. Чаще всего при пептидном картировании используют достаточно специфичный фермент трипсин. После проведения трипсинолиза белка обычно образуется большое количество коротких пептидов, имеющих различное время удерживания во время хроматографии. Чаще всего для пептидного картирования используется обращенно-фазная ВЭЖХ на колонках с фазой С18, а в качестве детектора - UV-детектор. Сопоставляя хроматограммы трипсинолизатов стандарта и белка, полученные в одинаковых условиях можно однозначно определить соответствие аналита стандарту.
При протеомике также часто используют трипсинолиз белка для получения дополнительной информации об белке с неизвестной структурой во время масс-спектрометрического анализа: в результате трипсинолиза и последующего масс-спектра мы получаем не только массу белка, но и массу его "кусков" находящихся между аргининами и лизинами. При соответствующем разрешении масс-спектра можно определить брутто-формулы данных пептидов, а следовательно и содержание в них аминокислот (но не их порядок). В идеале по этим данным можно собрать аминокислотный состав и самого, исследуемого белка.
Вообщем, Анна, пока у Вас есть только изократический ВЭЖХ хроматограф с УФ-детекторам, то я бы посоветовал Вам пока "потренироваться" и получить хроматограммы сначала стандартов белков, а затем их трипсинолизатов. В изократике это сложно сделать нормально (снимать, скорее всего, придется ступеньками), но чтобы хотя-бы отработать саму технику и условия трипсинолиза, вполне может сгодиться. Вообще главное в этом деле - хороший трипсин. Часто говорят, что достаточно "обычного" - "TPCK treated" трипсина (например, №T8802 Sigma ). Не знаю, не пробовал. На нашем предприятии используют трипсин качества "Proteomics Grade" - № T6567 Sigma. Интересно бы было сравнить их.
Удачи.

sakurako's picture

о картировании

Василий, спасибо большое!
Я уже проникалсь, можно попробовать, осталось вдохновить всех остальных
 

Taralvas's picture

 Доброго

 Доброго дня.

Поделюсь опытом начинания протеомных исследований с нуля
Любой биологический образец содержит очень много белков, различающихся концентрацией порядков  на 8
Для плазмы актуально иммуноафинное удаление интенсивных белков (использую Sigma PROT20).
Оставшиеся белки делятся при помощи 2D-фореза (чем больше гель, тем выше разрешение), и денситометрически (полуколичественно) определяются белки, различающиеся в контрольной и опытной группах  (Тут нужно нанести одинаковое количество белка, для чего определить его концентрацию в образце). После чего пятна вырезаются, гидролизуются в геле и втыкаются через хроматограф в масс-спектрометр.
Весь пул белков втыкать смысла нет, ничего хорошего не найдёте.
Определить аминокислотный состав по мол массе совсем затруднительно. Нужно использовать тандемный масс-спектрометр с ионной ловушкой. Это позволит определить порядок аминокислот в пептиде и идентифицировать белок. Также становится не критично время удерживания. После идентификации белок (или пептид) необходимо получить (синтетически или с геля) в чистом виде и вводить его гидролизат с изотопной меткой в качестве внутреннего стандарта.

Я использую масс-спектрометр AB Sciex  4000QTRAP с наноспреем (даёт бОльшую чувствительность по-сравнению с обычным электроспреем). Хроматограф Dionex ULTIMATE 3000 с делителем потока 1/1000 и двумя градиентными насосами. наноколонка С18 Acclaim Pepmap.

В идеале, масс-спектрометр Orbitrap с хроматографом, дающим нанопоток без делителя.

Дмитрий's picture

 Проводим

 Проводим хромато-масс-спектральные анализы растительных экстрактов (эфитные масла, сверхкритические СО2 экстракты http://vk.com/massspectrometry

О пользователе

sakurako's picture
User offline. Last seen 7 years 27 weeks ago. Offline
Пользователь



Настоящее имя Анна

Пол женский

Дата рождения 28/04/1979



Joined: 11/01/2012