Зависимость эффективности гель-фильтрационной колонки от наличия предколонки и объема вкола

Недавно задали вопрос: как оценить эффективность хроматографической системы при гель-проникающей хроматографии и что делать если эффективность, определяемая так же как и в паспорте, не соответствует (значительно ниже) заявленной.

Оказалось, что в принципе, все делалось правильно: все капиляры были заменены и обжаты для недопущения появления "мертвого" объема, лучшей методики, чем прописана в паспорте не бывает, да и не нужно (даже вредно) изобретать велосипед. Вообщем случай оказался не простым и надо разбираться дальше по частям: хроматограф, колонка и т.д. - ведь принципиальное отличие гель-проникающей хроматографии в том, что если при использовании т.н. "сорбционных" метоов (RPC, ИОХ, HIC и т.д.) в которых на эффективность хроматографической системы влияет только колонка и участок от колонки о детектора, то в случае ГПХ одинаково значимо качество ВСЕГО хроматографического тракта - от насоса до детектора.

Но повторю основные правила по определению эффективности, которую желательно проверять:

1. Эффективность определяется по пику низкомолекулярного вещества (ацетон, толуол, соль и т.д.);

2. Объем аналита вносимого для теста вещества должен быть не более 2% от объема колонки.

3. Ассиметрия пика должна быть не более 1,2.

4. Объем элюции должен незначительно отличаться от расчетного внутреннего объема колонки (матрица - уменьшает, а хроматографический тракт - увеличивает объем элюции).

Теперь перейдем от общего к частному.

Чтобы вспомнить какая же у нас эффективность колонок я начал разбираться и обнаружил несколько любопытных вещей, на которую раньше не обращал внимания, но сейчас бы хотел сейчас акцентировать Ваше.

1. Влияние предколонки на эффективность хроматографической системы.

Как оказалось влияние предколонки может быть очень значительным, так на рисунках 1-2 приведены для сравнения хроматограммы одного и того же препарата, содержащего в себе белок и низкомолекулярные примеси - аминокислоты.

Рисунок 1. Хроматограмма (нижняя), полученная без преколонки и характкристики пиков (внизу рисунка): P1-белка, Р2 - низкомолекулярной примеси.

Рисунок 2. Хроматограмма (верхняя), полученная с преколонкой и характеристики пиков (внизу рисунка): P1-белка, Р2 - низкомолекулярной примеси.

Как хорошо видно из приведенных рисунков эффективность хроматографической системы, определяемой по пику Р2 снизилась с почти 39000 теоретических тарелок до 28000, т.е. более чем на 25%, при этом его асимметрия данного пика ухудшилась с 1.09 до 1.14.

При проведении данного и подобного ему, по количеству и разрешению пиков, анализа данное ухудшение, зачастую, не критично, но при анализах более сложных смесей об этом необходимо помнить.

Также хочу обратить внимание, что в данном случае использование пика низкомолекулярной примеси в качестве маркера эффективности хроматографической системы совершенно правомерно, т.к. соответствует всем вышеприведенным правилам, и, следовательно, может быть использовано как для определения пригодности хроматографической системы, так и служить индикатором выхода из строя колонки в следствии, например, ее постепенного засорения. В данном случае еще очень удобно то, что основной длиной волны является 210 нм, на которой, при достаточной концентрации, прекрасно видны практически все соединения - на 280 нм мы бы второго пика не увидели.

2 Влияние объема инжекции на определяемую эффективность хроматографической системы

Выбирая хроматограммы для иллюстрации эффективности колонки я еще обратил внимание, что даже при объеме аналита значительно меньшем указанных выше 1-2% от объема колонки, определяемая эффективность может очень значительно разниться в зависимости от объема вкола (Рисунок 3).

Рисунок 3. Зависимость эффективности Н1 и Н2, соответвтвенно, пиков веществ Р1 и  Р2, от объема вкола при использовании колонки YMC-Pack Diol-SEC 500*8 мм с предколонкой.

Объем указанной колонки около 25 мл, т.е. 1% от ее объема составляет 250 мкл. Но мы видим, что вколы значительно меньших объемов приводят к в разы отличающимся значениям эффективности, что тоже надо учитывать, как при проведении анализа, так и при тестировании хроматографической системы.

Похожую картинку я наблюдал при анализе той же смеси на колонке с другой геометрии (рисунок 4)

Рисунок 4. Зависимость эффективности Н1 и Н2, соответвтвенно, пиков веществ Р1 и  Р2, от объема вкола при использовании колонки TSK 3000 SWxL 250*4.6 мм без предколонки.Подвижная фаза и линейная скорость прежние.

Тут, конечно, с корреляцией все грустнее (степенная значительно лучше), но:

1. тенденция прослеживается четко: чем меньше вкол, тем выше эффективность

2. у вещества с меньшей мол. массой эффективность, т.е. размытие его пика,  сильнее зависит от объема вкола.

Других выводов пока нет, но было любопытно:)

Всем удачи и весеннего настроения!

О пользователе

Василий аватар
User offline. Last seen 25 недель 15 часов ago. Не в сети
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Зарегистрирован(а): 20/05/2009