Оценка динамической емкости сорбентов, используемых при препаративной хроматографии белков

В предыдущем посте я много писал про подбор условий. Так вот, понятно, что подбирать можно все что угодно, но, считаю, что первоначально необходимо провести скрининг именно неподвижной фазы - сорбентов. Да и в практике достаточно часты частные случаи, когда по разным причинам (прекращение выпуска используемого сорбента, перебои с поставками, значительные различия характеристик от партии к партии, дороговизна и т.д.) приходится подбирать сорбент под существующую технологию. И в этом случае все остальные параметры (состав и объем подвижных фаз, температурные режимы, объемные скорости ), ну может за исключением градиента, очень желательно сохранить прежними. Вообщем задача поиска оптимального сорбента всегда злободневна и является одной из основных. Так как же ее решить с минимальными затратами? Ну в первую очередь конечно надо ознакомиться с каталогами фирм-производителей сорбентов и выбрать оптимальные, исходя из заявленных характеристик. Но сильно верить им нельзя, конечно, т.к. все заявляют, что их сорбенты самые лучшие и превосходят конкурентов. Я, например, выбираю просто - нужен катионообменник - их и беру из перечня. Если нужен катионообменник для, допустим, ПЕГилированных белков - выбираю специальный или с самыми крупными порами. Нужна максимальная емкость - выбираю сильный ионообменник. Ну и из прочих сопутствующих и, вроде как, не основных характеристик (стабильность в условиях разделения и санитизации, максимальное давление, пористость фриты и т.д.). После такого отбора наступает самое важное - проверить основные характеристики, которыми являются динамическая емкость (dynamic binding capacity - DBC) и селективность. Ну про селективность можно рассуждать практически бесконечно: бесчиссленные тома написаны умными людьми и пока я, например, не сформулировал хоть каких то общих правил для ее оптимизации: каждый раз что-то новое и надо рассматривать каждый конкретный случай. Ну а вот про динамическую емкость поговорить стоит, т.к. во-первых, измерить динамическую емкость достаточно просто, во вторых, динамическая емкость - самый популярный среди маркетологов фирм-производителей параметр, на который зачастую и давят при рекламе своих сорбентов, причем иногда используя не совсем корректные формулировки, что может вводить в заблуждение, в третьих, самостоятельно изучая данную характеристику сорбентов можно узнать много нового и полезного о свойствах сорбентов. 

Во первых, как проверяется динамическая емкость хроматографического сорбента? Делается это, казалось бы,  просто: берется колонка, уравновешивается стартовым буфером, затем наносится материал до тех пор, пока сигнал детектора (обычно это UV-детектор) не достигнет некого критического значения. На этом эксперимент может быть окончен, т.к. объем прокаченного материала как раз и характеризует. емкость сорбента. Сравнив таким образом несколько сорбентов вы уже будете иметь некую реальную информацию для адекватного анализа. На рис. 1 как раз представлена самая наглядная иллюстрация проведения теста на динамическую емкость. 

Рис. 1 Хроматограмма, получаемая при DBC тесте анионообменного сорбента.

Хорошо видно, что в качестве критического значения сигнала детектора было выбрано зачение в 10% от сигнала, который выдает детектор в тот момент когда произошло насыщение сорбента. В принципе можно сделать немного по другому, предварительно прокачав материал через  колонку и, таким образом, зафиксировав (запомнив) данное значение, а потом уже проводить тесты сорбентов до тех пор, пока сигнал детектора не достигнет зафиксированного ранее значения. Зачастую, при DBC-тестах как раз и используют значения в 10% или 5% от сигнала приполном проскоке (BreakThrough). Но не суть важно. Важно другое: данное описание эксперимента мало информативно без дополнительных параметров хроматографического разделения, которые в дальнейшем могут значительно влиять на эффективность применения разработанной методики. Так даже если бы были описаны такие важные параметры, как состав подвижной фазы и наносимый материал, все равно описание было бы не полным и не учитывающим множества факторов. Так, например, известно, что емкость значительно зависит от линейной скорости нанесения (рисунок 2-3).

 

 Рисунок 2. Зависимость DBC сорбента от линейной скорости нанесения.

 

 Рисунок 3. Зависимость DBC сорбента Poros от линейной скорости нанесения.

Как видите тут уже проведено как минимум 6 экспериментов.

Иногда экспериментальные данные по зависимости DBC сорбента от линейной скорости нанесения представляют в других координатах: DBC и т.н. Residence time (RT). При этом RT=объем сорбента/объемную скорость ПФ (рисунок 4).

 Рисунок 4. Зависимость DBC сорбентов от RT.

Видно, что  графическое отображание в данных координатах обратно, представленному ранее, и не несет ни какой дополнительной информации кроме еще большей путаницы, для чего, видимо, и задумывалось. Но не суть.

Главное, что на предыдущих рисунках проиллюстрированы только частные случаи определения динамической емкости с использованием только одной конкретной буферной системы. В то же время, зачастую, условия хроматографирования, в силу разных (технологических, временных и т.д.) условий, для одного и того же белка могут варьироваться в достаточно большом диапазоне значений. Например, при использовании ионообменной хромаографии определяющими являются ионная сила и рН материала. И в этом случае может оказаться, что необходимо определить зависмость DBC  уже не от 1, а от 2 параметров (рисунок 5).

  Рисунок 5. Зависимость DBC катионообменного сорбента от рН и ионной силы. 

Интересно, сколько было проведено экспериментов и было потрачено времени на получение этой красивой картинки? По моим подсчетам не менее 165 (11 значений рН и 15 значений ионной силы). Безумное, казалось бы,  количество, но за месяц сделать можно: что, в принципе, в масштабах разработки технологического процесса не так уж и много. НО! тут же не учтены ни скорость, ни составы буферных растворов, которые добавляют еще 2 измерения. И если с влиянием скорости, обычно все понятно и предсказуемо: емкость однозначно падает при ее увеличении, поэтому можно просто провести серию экспериментов при оптимальных значениях рН и ионной силы, то с использованием другого буферного раствора (или, даже, того же, но с другой концентрацией буферной соли!) для полной ясности необходимо провести еще такие же масштабные серии экспериментов, что уже наверняка не уложится во временные рамки разработки какого-либо производственного процесса. И это все для одного сорбента! А если их, хотя бы, 3? На рисунке 6 показан объем бедствия и уже 9 прекрасных картинок, для получения которых трудился, наверное, целый институт:)

  Рисунок 6. Зависимость DBC трех катионообменных сорбентов от рН, ионной силы и скорости нанесения. 

Вообщем понятно, что в здравом уме такой работой можно заниматься только в тюрьме, осточертенев от безделья, или в каком-нибудь НИИ по той же причине, от безделья, ну и ради статьи, конечно:). В результате, при пракической разработке метода технологи больше руководствуются своим опытом и проводят 5-10 экспериментов для достижения необходимых характеристик процесса и оставляют совершенствование "на потом", которое, зачастую, не наступает никогда и технология так и остается недоработанной.  

Понимая это, производители хроматографического оборудования придумывают разные аппаратные и программные решения, предназначенные для автоматизациии, соотвественно, сокращения времени проведения экспериментальной работы, в том числе и для определения DBC. Так GEhealthcare, кроме описанных мною ранее, систем BufferPrep и Scouting также внедрила в ПО Unicorn систему планирования эксперимента (Design of Experiments), позволяющую значительно снизить количество опытов для получения необходимого объема данных. Также, для ОЦЕНКИ динамической активности и условий элюирования сорбентов собственного производства, GEhealthcare разработала систему PreDictor plate. Данная система, основанная на использовании стандартных 96-ти луночных ячеек с внесенным в них сорбентом, достаточно интересная, но пока все делается вручную, явной выгоды, кроме экономии материала, не заметно, да и контроль условий в каждой ячейке затруднителен. Но иллюстрация результатов (рисунок 7) выглядят достаточно информативными, тем более, что GEhealthcare разработало специальный софт для обработки результатов: Assist software.

 Рисунок 7. Оценка условий элюирования, полученная с использованием PreDictor plate и Assist software.

Таким образом, вышеперечисленные аппаратные и программные решения GEhealthcare, а также других производителей, хоть и облегчают оценку свойств сорбента, но не лишены значительных недостатков и ограничений применимости, поэтому основой успешной работы все равно остается опыт экспериментатора в подборе граничных условий эксперимента. Тем более, что динамическая емкость является далеко не единственной характеристикой сорбента, которую необходимо определять при создании оптимальной технологии.

Так, например, нанести побольше белка на колонку не самоцель хроматографии (кроме совсем уж редких случаев):  его надо еще и снять с максимальным выходом в приемлемых для белка условиях и об этом я попробую порассуждать в другой раз.

А сейчас поздравляю всех с праздниками и желаю прекрасно провести время на выходных.

 

 

О пользователе

Василий аватар
User offline. Last seen 8 недель 20 часов ago. Не в сети
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Зарегистрирован(а): 20/05/2009