Особенности проведения ВЭЖХ анализа на колонках с "мягкими" сорбентами

Исходные данные эксперимента
Использованное оборудование: 
Прибор: жидкостной хроматограф фирмы Dionex UltiMate 3000 в составе: автосемплер - WPS-3000; насос – LPG-3400A; термостат - TCC-3000; UV-детектор - VWD-3100; Колонка Superose 12 10/300 GL

В аналитической хроматографии довольно широко распростраены методы, в которых используются хроматографические колонки с "мягкими" сорбентами. Это, в основном, сорбенты на основе сверхсшитых природных углеводных полимеров декстрана, агарозы и т.д., выпускаемые под марками Sepharose, Superdex, Sephadex и т.д. Данные марки сорбентов имеют достаточно слабое сопротивление потоку, но имеют очень низкий предел по давлению (от 3-5 до 30 бар ). В то же время, зачастую, лаборатории используют ВЭЖХ хроматорафы, предназначенные для работы с колонками, заполненными "жесткими" сорбентами у которых рабочее давление в районе 100 и более атмосфер. И конструкция данных хроматографов предусматривает гашение возможных флуктуаций давления, вызванных работой насосов, именно в этих диапазонах давлений. Когда же в хроматограф установлена колонка с "мягким" сорбентом то, соответственно, давление в системе практически нулевое и ВЭЖХ система попросту не может компенсировать возникающие флуктуации давления, а, возможно, и потока, что может приводить к увеличению размывания пика и другим последствиям.

Вот, например, что происходит с давлением при работе с колонкой, диаметром 5 мм и наполненной 100 мкл аффинного сорбента на основе Sepharose CL 4B.

Рисунок 1. Показания датчика давления

А вот так (неровности на хроматограмме) это сказывается на сигнале UV-детектора

Рисунок 2. Флуктуации сигнала UV-детектора

... и FLD-детектора.

Рисунок 3. Флуктуации сигнала FLD-детектора

 Сопоставление хроматограмм:

 Рисунок 4.Наложение хроматограммы, полученной при 280 нм, на колебания даления.

 Рисунок 5. К предыдущему рисунку добавлена хроматограмма с FLD-детектора.

 

Похожая картина наблюдалась при использовании колонки HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade. Только в данном случае пульсации давления постепенно наростали, а затем, почему то прекращались и опять начинали расти. Единственное, что смог понять, так это то, что во время прекращения "скачков" выполнялись следующие наборы команд Chromeleon 7:

63.239   Compression limit reached.

65.848   Compression back to normal.

Что это за команды и почему они вдруг начинали исполняться я так, к сожалению, и не смог понять.

 

 Рисунок 6. Наложение хроматограммы, полученной при 280 нм, на колебания даления при использовании  колонки HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade.

Хорошо видно, что колебания давления приводят к дрейфу базовой линии.

При использовании Superose 12 GL 10/300 тоже иногда появляются подобные флуктуации давления. Хочу отметить, что на данной колонки флуктуации давления появляются действительно "иногда". Скорее всего это действительно связано с тем, что существует какое-то пограничное давление, выше которого подвеска, т.е. демпфер, начинает срабатывать и гасит колебания, а при давлении ниже этого не происходит. Данная, же колонка, вероятнее всего, создает давление на границе данного порога и (как мы видим это порядка 10-15 бар) поэтому состояние очень неустойчивое и то есть колебания, то нет.

Рисунок 7. Колебания даления при использовании  колонки Superose 12 GL 10/300.

Резюмирую хочу сказать, что по большому счету с данными колебаниями можно смириться и, зачастую, влияние их на результат мимнимально, но просто об этом надо знать и быть к этому готовым, т.к. первый раз увидив подобную "пляску" давления можно весь хроматограф разобрать выясняя причину. Но бывае, что мириться не получается, например колонка "работает" близко к верхнему пределу по back pressure и данные колебания легко могут прервать процесс, вызвав превышение давления, или флуктуации хроматограммы не позволяют правильно интегрировать пик. Тогда, если моя теория, про недостаточность давления для срабатывания демпфера верна, то необходимо увеличить давление в системе, для чего между насосом и колонкой (ни в коем случае не после колонки!) необходимо поместить какое-нибудь "паразитное" устройство, создающее доп. давление. Это может быть и просто кусок тонкого капиляра. Главное, чтобы размытие в этом "устройстве" было как можно меньше.

Всем хороших выходных.

О пользователе

Василий's picture
User offline. Last seen 12 weeks 5 days ago. Offline
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Joined: 20/05/2009