Воспроизведение новой метоики или еще раз про уравновешивание

Всем здравствуйте! Давно не брал я в руки "шашки", а тут что то "занесло" и, знаете, на такой ерунде, что решил написать.

Не секрет, что воспроизводить методики прописанные в НТД и прочих фармакопеях то еще приключение: ни когда не знаешь, то ли все на ура (что рекдко, но надеешься, же! :)) то ли ты как дурак долго пытаешься понять, да и другим объяснять, что вот так уверенно и безапеляционно написанный документ (даже марку колонки прописали!) - далеко не истина в последней инстанции (это конечно, чаще) - и копать еще и копать. Вообщем очень эмоционально насыщенный и непредсказуемый процесс и все (нормальные люди) об этом знают и ожидают всего  чего угодно и, как не странно, расхолаживаются и... забывают про самое простое. Так вот, начали мы отрабатывать очередное пептидное картирование: методика в фармакопее есть и вся очень поробно прописана. Градиент, естественно тоже есть - мы его честно переписали (рис. 1). Как обычно при пептидном картировании это аж 2,5 часа праздника и очень часто его не поотрабатываешь - проба элементарно высохнет:)

Рисунок 1 - Градиент

 Ну и запустили (кто уже понял - поставте себе 5! :)) мы с этим градиентом все как положено: бланк, матрицу, образец, повтор....

Вообщем, к концу рабочего дня я вдруг заглянул и вижу удручающую картину: в образце все вывалилось в начале и .... пустота! Повтор пошел - пик вкола повторился идеально! :) (Рис. 2)

Рисунок 2 - Наложенные хроматограммы образца и повтора

Но, напоминаю, это попытка воспроизведение фармакопейной методики и, люди, кстати очень квалифицированные (может чуточку переквалифицированные и уставшие, поэтому циничные) поэтому готовые ко всему, со спокойствием Будд наблюдают все это непотребство, справеливо допуская, что "может в 5-й раз должно все выйти нормально" (такое редко, но, поверьте, иногда бывает) - просто в фармстатье "забыли" упомянуть об этом. Ну это же понятно - те кто их пишет, по моему, вообще небожители - им все можно.

Ну вернемся к действу: я тоже на это все посмотрел тоже пожал плечами, подрузамевая возможное влияние количество проведенных вколов на конечный успех результатов, но будучи только что оторванным от бесконечных бумаг был естественно с пустой головой и поэтому допустил, как всякий неофит, самую элементарную причину творящейся ерунды и решил проверить самое простое - доуравновешивается ли колонка. И переключил на давление: велик тот кто приумал, что давление стоит записывать как сигнал детектора (Dionex - верный апостол этой "веры")  поэтому мы увидели следующую картину:

Рисунок 3 - Профиль давления в хроматорафическом тракте образца и его повтора

Как мы видим формально хроматография начинается и заканчивается одним и тем же давлением, т.е. вроде все нормально, но это только так кажется. На самом деле там еще в конце и скорость выше (на рисунке не показан переход), да и вообще давление должно выравниваться после возвращения к исходным параметрам ПФ! Выравниваться и держаться не менее 0,5-1  мин (для ОФ ВЭЖХ).

После этого я посмотрел профиль градиента, спросил: "Как так?" Услышал: "В фармакопее так". Вообщем исправили немного градиент (рисунок 4).

Рисунок 4 - Градиент, исправленный

И получили слеующий результат:

Рисунок 5 - Хроматограмма образца после измененного градиента.

Как вы видете, добавление уравновешивания кардинально изменило получаемую хроматограмму и она стала хоть отчасти походить на требуемую.

А вот как при этом стал выглядеть профиль давления:

Рисунок 3 - Профиль давлений в хроматорафическом тракте до (синий) и после (коричневый) изменения граинета.

Как теперь хорошо видно добавление уравновешивания в конце программы привело к изначальному давлению, а, следовательно, изначальному составу ПФ во время вкола, что, соответственно, не позволило проскочить образцу через неуравновешенную колонку. Так мы продвинулись чуть дальше, жаль что не все так просто будет дальше: с этой методикой мы еще помучаемся - мудрые составители фармстатьи умурились вставить в нее референсный профиль хроматограммы у которого последний пик олжен выйти на 70-й минуте, но и это пройдет:)

В результате какое можно сделать заключение по воспроизведению нового метода:

1. Уравновешивайте всегда и с запасом и не бойтесь, что это не будет соответствовать НТД, т.к. иногда описывают только рабочий профиль градиента!

2. Если вы увидели большой пик вкола, а дальше чистую хроматограмму: не пугайтесь у вас всетаки произошла инжекция и работает детектор.

3. Если а) у вас методика с ОФ ВЭЖХ и б) метод начинается с 0% растворителя, то белки ВСЕГА должны "садиться", какая бы у вас фаза не была: хоть С4, хоть С18. Если же не садится, то или недоуравновешено или с колонкой нелады. Другого не дано.

Всем хорошего настрооения и удачной недели.

 

 

 

 

 

 

О пользователе

Василий's picture
User offline. Last seen 29 weeks 3 days ago. Offline
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Joined: 20/05/2009