Определение объема эксклюзии крупнопористых сорбентов для гель-хроматографии

В биотехнологии, особенно при производстве вакцин, широко используется гель-проникающая хроматография, причем как в производственном процессе, так и при контроле качества. При этом вакцинные препараты, зачастую, гетерогенны по своему составу и имеют достаточно широкий диапазон молекулярных масс, что влечет необходимость использования крупнопористых гель-фильтрационных сорбентов с пределом эксклюзии в несколько мегадальтон. Сколько точно, ососбо даже не важно: главное, что больше 2МДа! Почему? Да потому что в широком доступе, для определения V0,  есть только Blue Dextran с такой Mr! И если вам точно надо определить V0 у Sepfacryl 400-1000 (рисунок 1), Sepharose 4, Sepharose 2,   TSK Gel 4000 и т.д., то вы столкнетесь с большими трудностями. Так, напраимер, на запрос в Gehealthcare по данному поводу мне ответили, что их специалисты используют "raw dextran", который готовят сами и для покупателей он, естественно, не доступен. Методика его получения тоже непонятна и не разглашается (может клейстер варят?).

Рисунок 1. Диапазоны рабочих Mr, для сорбентов Sephacryl.

А на рисунке 2 вы как раз видете стандартную иллюстрацию, приводимую в различных брошюрах и Handbook's от Gehealthcar и вот первый пик с Mr>20*106 как раз и есть этот вожделенный метчик для V0.

Рисунок 2. Калибровка крупнопористых сорбентов с использованием 3-х декстранов.

Вообщем, конечно, клейстер сварить то можно, но потом как его использовать, например, в фармстатье? Внутренний стандарт делать и потом его охарактеризовывать и регистрировать та еще проблема. Поэтому начал искать-искать и ... нашел! Правда немного не точ, что нужно:) Так по данной ссылке: http://www.separations.asia.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/Par...  - можно найти перечень полистиреновых и полиетиленоксидовых стандартов для калибровки колонок. К сожалению, меня в настоящий момент интересуют сорбенты Sephacryl и Sepharose и используюу водные буферные растворы. В связи с этим полистиреновые стандарты, требующие использования подвижных фаз на основе растворителей, мне не подходят. Стандарты полиэтиленоксида, в свою очередь, возможно использовать в водных подвижных фазах, но максимальный размер приведенных стандартов не более 1 МДа, чего может не хватить не смотря на повышенный, по сравнению с глобулярными белками и прочими природными полимерами, имеющими иррегулярную структуру, гидродинамический радиус (радиус Стокса). К тому же большим недостатком использования данного типа полимеров, является необходимость использования достаточно редких типов, особенно в препаративных хроматографах, детекторов: рефрактометрических, светорассеивающих, заряженных аэрозолей и т.д. Я, правда, имею возможность использовать УФ-детектор с настраиваемой длиной волны и устанавливаю 205-210 нм: на ней тоже достаточно хорошо видно, но хочется делать правильно, да и не всегда и не у всех такая возможность есть.  

В приведенной ниже статье, приведен, как мне кажется, оптимальный выход из создавшегося положения: использование плазмидной ДНК в качестве стандарта для определения V0 . В данной статье,например, используется DNA molecular weight Marker II (Roche Diagnostic), который представляет собой препарат ДНК из бактериофага λ, "нарезанный" при помощи эндонуклеазы HindIII. Самый большой фрагмент ДНК в данной смеси более 23 кБ, что в пересчете на молекулярную массу составляет более 9 МДа, что вполне достаточно для охарактеризования таких сорбентов, как Sepharose 4B FF и Sephacryl 400. При этом следует учитывать, что ДНК, особенно плазмидная, в растворе имеет не глобулярную, а линейную форму, что также значительно, вероятно в разы, увеличивает гидродинамический радиус. В следствии этого данный препарат можно использовать и для более крупнопористых сорбентов, но это можно проверить только экспериментально. Конечно, можно, использовать и другие препараты плазмидных ДНК с большей массой. В тоже время, Sigma предлагает препараты ДНК из тимуса теленка или ДНК из молок лососевых рыб, но они, по моему мнению, недостаточно охарактеризованы. Но у препаратов ДНК есть большой плюс: они легко детектируются при помощи самых распространенных - УФ-детекторов.

Вообще, проблема определения Vo достаточно специфичная и в качестве маркера можно использовать любые молекулы или частицы превышающие объем пор, т.е. даже препараты клеток, если это возможно по технологии и/или если частицы проходят через фрит.

Также, иногда, для определения Vo можно использовать растворы детергентов с концентрациями большей, чем предельная концентрация мицеллообразования (CMC - англ.). Данные по CMC для всех основных  детергентов приведены тут.

Вообщем, как Вы видите проблема достаточно интересная, но решаемая.

Надеюсь, что данная статья кому-нибудь поможет пораньше прийти домой, когда такая замечательная летня погода! Всех с наступающим летом и прекрасного отдыха!

P.S. Реал только что 2-й гол забил!

AttachmentSize
статья.pdf492.8 KB
Константин's picture

стандарт для Vo

Всем привет!
Когда-то давно я очищал тромбоциты крови от остальных белков крови с помощью Sepharose 2B. Клетки выходили в мертвом объеме. Как мне кажется, для простоты можно использовать эритроциты. Размер эритроцита ~ 10 мкм.
Константин

О пользователе

Василий's picture
User offline. Last seen 12 weeks 5 days ago. Offline
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Joined: 20/05/2009