Система BufferPrep для скрининга условий хроматографического разделения в Unicorn

Разработка любого хроматографического (аналитического или препаративного по цели) метода требует значительных временных и материальных затрат в связи с тем, что зачастую необходимо найти оптимальное соотношение множества значимых факторов: дешевизна, временные затраты, воспроизводимость, чувствительность, потери и т.д. и т.п. В результате необходимо провести большой объем экспериментальной работы как на этапе предварительного выбора оптимальных и/или отсева совсем неподходящих условий , так и на стадии отладки окончательной доводки методики. К тому же сам процесс  разработки метода должна быть как можно более прозрачен и ясен для заказчика и/или начальника, зачастую слабо разбирающегося в процессе хромаографии, в результате чего если вы просто предоставите методику по прошествии некоторого метода, то будет сложно объяснить на что было потрачено время и деньги, раз "так все просто":). Поэтому, зачастую, сам процесс разработки метода заключается в проведении серий параллельных экспериментов, в которых изменяется один (реже больше) из параметров (колонка, pH, растворитель, содержание хаотропа и т.д.). И, понятно, что самым критичным для дальнейшей интерпритации результатов является воспроизводимость параметров хроматографического разделения. Воспроизводимость может достигаться разными способами, но, к сожалению, зачастую, в ручную, даже при наличии возможности автоматизации.

Так в нашей стране стоит достаточно большое количество хроматографических ситем Akta для жидкостной препаративной хроматографической хроматографии, под управлением Unicorn. И, зачастую, данные системы также используются для разработки методов. При этом основным применением данных систем, является ионообменная хроматография белков, при этом основными параметрами являются: неподвижная фаза (с учетом геометрии колонки и физических характеристик сорбента), материал, его объем и условия нанесения, объем промывки, рН и кондуктивность на разных атапах процесса, градиент элюции.

В результате, если, к примеру, мы хотим оптимизировать условия посадки-элюции какого-либа белка с использованием какой-либо буферной системы при 4 значениях рН, 4 значениях кондуктивности стартового буфера и на 4 различных колонках, то нам необходимо будет произвести как минимум (при 1 повторности) 64 эксперимента! При средней продолжительности эксперимента в 20 минут и непрерывной работе данная процедура займет более 21 часа. (И это далеко не предел, так как, например, хроматографы Акта позволяют тестировать до 7 колонок различной геометрии.) При этом следует учитывать, что если делать классически, так сказать, "в ручную", то следует предварительно приготовить 4 пары буферных растворов с разными значениями рН и менять их придется также в ручную. Также придется написать отдельные программы, учитывающие особенности хроматографических колонок и сорбентов в них и запускать их опять же по очереди в ручную. Вообщем понятно, что проблема будет даже в том, чтобы ни чего не перепутать и, не повторять потом снова. Тем более мало надежды на точном воспроизведении выбранных условий в случае необходимости повтора всего или части эксперимента.

В результатеостается надеяться только на авось, или на опыт, если он есть. Пару раз у меня получилось очень удачно, но, по результатам, опрометчиво, т.к. сначала у всех была эйфория (у меня, не скрою, тоже), но быстро сошла на нет, т.к. был поставлен вполне резонный, с точки зрения непрофессионала (начальника) вопрос: "а может это все так просто, разработать технологию, раз так быстро все получилось"? Обидно, конечно, но ведь объективно то я осознавал, что проверил далеко не все что мог: 2-3 подвижных фазы на 2 в одном и 5 в другом случае сорбентах и возможно условия далеки от оптимальных и подобрав первую удачную пару для опытного или даже промышленного производства надо бы не останавливаться и подобрать более оптимальные условия, т.к. даже увеличение выхода и (или) уменьшение времени процесса на несколько позволяет значительно сэкономить/заработать и тем самым повысить рентабельность производства. Но уж больно затратен этот процесс по времени, силам и расходным материалам (если все делать вручную), по уже приведенным выше причинам.

Вообщем проблема поиска оптимальных условий хроматографического процесса за приемлемое, что очень важно, время, занимала меня постоянно. Но в силу множества причин, только в последнее время "звезды сошлись" так, что появились и время и средства, чтобы попробовать одну теоретически очень полезную, но, к сожалению, практически не используемую на просторах нашей прекрасной страны функции управляющей программы Unicorn - функция BufferPrep. Поэтому приходится почти всему обучаться самому, правда с неоценимой помощью Александра Веретенникова (GE). Спасибо ему огромное.

В кратце: BufferPrep позволяет используя набор из 1 (одного) буферного раствора, 1 (одного) раствора соли, одного растовра кислоты/щелочи и воды !!!! - проводить серию экспериментов любой степени подробности, сканируя весь рабочий диапазон используемого буферного раствора при различных значениях проводимости стартового буфера. При этом для всех используемых расторов приводится подробная пропись приготовления - смешивай и не парься (рис.1). Феноменально! Вроде бы. Но как обычно: было гладко на бумаге, да забыли про овраги:)

Рис. 1. Пропись приготовления растворов.

Оврагами в данном случае являются некоторые ограничения, которые, в общем случае, позволяют выбрать оптимальный диапазон (но не условия!) хроматографического разделения, а вот оптимальные условия из этого диапазона придется выбирать уже самостоятельно, в ручную. Но это не так уж и страшно, т.к. за счет скрининга возможно сузить диапазон очень значительно, т.к. на нем будет отсечено большинство неподходящих вариантов.

Основные ограничения:

1. Невозможность прямого определения, и, соответственно, изначальной установки точной концентрации буферного раствора (она меняется в зависимости от установленного значения рН, что видно по изменению проводимости (рис.2))

Рис. 2 Изменение кондуктивности при различных при различных значаниях рН. Данные получены на хроматографе Akta Purifier 100 в режиме Bypass (для исключения влияния сорбента).

Хорошо видно, что при переходе от рН=3 к рН=7,5 кондуктивность изменяется на 2 мСм/см (от 4 до 6 мСм/см), что соответствует разнице примерно в 20 мМ буферной соли.

2. Несоответствие устанавливаемых в Unicorn значений рН, рН получаемых растворов. Так после калибровки встроенного датчика рН были получены следующие показания:

Номинал          Показания
     4.0                     3.99
     7.0                     7.03
     9.21                   9.29
 
После этого, при использовании BufferPrep (опять же без колонки) фиксировались значения как встроенного датчика - колонка "Прибор", так и измерялись стоки при помощи стационарного рН-метра - колонка "рН-метр".
 
Номинал            рН-метр          Прибор
     7.0                  6.676                6.44
     5.5                  5.263                5.01
     4.0                  3.459                3.26
     3.0                  2.293                2.14
     6.0                  5.785                5.56
     7.0                  6.650                6.59

Как видим значения имеют достаточно большие отклонения, как от установленного номинала (от 0,2 до 0,86 ед. рН), так и, что очень важно, значения между показаниями прибора, получаемые в потоке, и лабораторного рН-метра, получаемые в состоянии покоя. Какие из них истинные и, соответственно, заслуживают внимания, я пока не понял. Но факт в том, что "с колес", конечно можно работать с данной системой, но лучше дополнительно провести предварительные (к счастью непродолжительные) исследования и ввести поправку на такие отклонения, т.к. "влететь" почти в рН=2, вместо ожидаемых 3, позволит получить "удивительные" результаты, вплоть до потери сорбента, ну а белка и подавно:).

3. Наноисмый образец во всех экспериментах серии используется один и тот же (нет возможности дотитровки/разведения образца). Ну это понятно.

4. Перечень готовых к использованию буферных растворов недостаточно широк, хотя присутствуют дажи полибуферы, покрывающие большие диапазоны рН. (Рис.3)

 

Рис.3 Скриншот с перечнем буферов, установленных по умолчанию.

Но в Unicorn существует функция по добавлению в перечень собственных буферов (Рис.4).

 

 Рис. 4 Способ добавления новых буферных растворов в BufferPrep.

С ней пока не совсем понятно как работать, но схема понятна и методом немногочисленных проб возможно использовать ее по собственному разумению. Также данную функцию можно использовать для получения основных физико-химических свойств буферных солей. (Рис.  5)

 

Рис. 5. Физико-химические свойства используемых буферных растворов.

На этом пока все, т.к. времени все таки на все не хватает. Как будут новые данные, обязательно напишу.

Всех с началом учебного года и всего наилучшего.

 

 

 

 

 

О пользователе

Василий аватар
User offline. Last seen 25 недель 15 часов ago. Не в сети
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Зарегистрирован(а): 20/05/2009