Теоретические основы хроматографии

При написании раздела данного в качестве основного источника были использованы книги  описывающие теорию на примере жидкостной хроматографии, в связи с этим следует учитывать эту специфику.

 Навигация

Принципы и основы теории хроматографии

 

Основные элементы хроматографического процесса рассмотрим на примере разделе­ния бинарной смеси в условиях колоночной жидкостной адсорбционной хроматографии. Представим себе трубку, заполненную простым адсорбентом (колонку), через которую не­прерывно течет растворитель (рис. 1.)

Рис 1 Хроматографическая колонка


Адсорбент (сорбент, наполнитель колонки) удерживается в колонке фильтрами, он неподвижен и поэтому называется неподвижной фазой. Растворитель, перемещающийся от­носительно сорбента, называется подвижной фазой (в некоторых случаях элюентом). Введем в верхнюю часть колонки по одной молекуле соединений - сорбатов, обозначенных да­лее Х и У (рис. 2). При движении вдоль колонки эти молекулы будут диффундировать внут­ри пор сорбента и, в результате межмолекулярных взаимодействий того или иного типа, адсорбироваться на поверхности неподвижной фазы.

 

         Время, в течение которого молекулы находятся в адсорбированном состоянии, определяется силой межмолекулярного взаимодействия сорбатов Х и У с сорбентом. При очень слабой сорбции молекулы почти все время проводят в растворе подвижной фазы и поэтому переме­щаются вниз по колонке со скоростью, лишь незначительно уступающей скорости движения подвижной фазы. Наоборот, при очень сильной сорбции молекулы Х и У почти не отрыва­ются от поверхности и скорость их перемещения по колонке незначительна.

        С точки зрения хроматографии нас больше всего интересуют такие условия, в кото­рых сила адсорбции промежуточная и скорость перемещения Х и У по колонке в 2-10 раз меньше скорости движения подвижной фазы. Явление замедленного движения молекул Х и У относительно движения подвижной фазы в хроматографии называется удерживанием. Ес­ли константы сорбции веществ Х и У различны, то различным будет и их средняя скорость движения по колонке. Молекулы Х в нашем примере сорбируются слабее, при движении по колонке обгоняют молекулы У и из колонки они выйдут в разные моменты времени. Таким образом, достигается основная цель хроматографии -разделение.

       Естественно, что на практике в колонку не вводят единичные молекулы и поэтому данная картинка предельно упрощает реальную ситуацию. Если в колонку введены хотя бы несколько молекул разного вида, то обнаружим, что средние скорости перемещения молекул X и У по-прежнему различны. Помимо этого, скорости перемещения отдельных молекул каждого вида отклоняются в ту или иную сторону от среднего для данного вида значения. Молекулы сорбатов , первоначально введенные в колонку в виде мгновенного импульса, выходят из нее более продолжительно, это объясняется тем, что в ходе хромато­графической миграции каждое индивидуальное вещество переме­щается в направляющей системе в ограниченном (постепенно изме­няющемся) объеме. Эти объемы и соответствующие им участки длины колонки, равно как пятна и полосы на хроматографической пластин­ке, будем ниже именовать. хроматографическими зонами, или просто зонами. Неидентичность скоростей перемещения одина­ковых молекул в хроматографии называется размываниемОно связано с рядом явлений в колонке, которые подробнее рассмотрим позднее. Это нежелательное явление приводит к тому, что среди молекул У могут находиться также молекулы Х, скорость которых близка к скорости наиболее "быстрых" молекул У. В результате зоны Х и У могут частично наложиться одна на другую и разделение окажется неполным.

       Процессы удерживания и размывания - предмет теории хроматографии.

       Некоторые основные термины и определения.

       Хроматограмма - кривая, изображающая зависимость концентрации соединений, вы­ходящих из колонки с потоком подвижной фазы, от времени с момента начала разделения (рис. 3).

         Рис3.

        Базовая линия соответствует тому промежутку времени, в течение которого детектор регистрирует сигнал только от подвижной фазы.

        Пик - кривая, в идеале приближающаяся к кривой гауссова распределения, описывает постепенное нарастание концентрации на выходе из колонки и последующем ее уменьше­нии.

        Время появления максимума пика на хроматограмме называется временем удержива­ния tr.

        При постоянных условиях работы и составе фаз хроматографической системы время удерживания является величиной постоянной для данного вещества. Иногда в начальной части хроматограммы регистрируется пик, природа которого связана с кратковременным на­рушением равновесия в колонке при вводе пробы. Этому пику соответствует время удержи­вания несорбируемого вещества to.

        Время удерживания также определяется скоростью подачи через колонку подвижной фазы v. Удерживаемый объем (объем эллюции зоны) данного вещества рассчитывается по формуле:

                 Vn=tn*v            (1)

  и не зависит для данной колонки от расхода.

            Параметр коэффициент емкости данного соединения в данной хроматографической системе рассчитывается по формуле:

            K=(tr-to)/to         (2)

        Этот параметр не зависит от размеров колонки и скорости потока и широко использу­ется в хроматографической литературе и работах. Физический смысл данного важнейшего коэфициента, еще называемого в литературе коэффициентом распределения двояк:
      во-первых, К=Мs/Mm, где Мs - масса (количество) сорбированного вещества, Mm - масса (количество) вещества находящегося в подвижной фазе в равновесии с сорбированным веществом (Мs);
      во-вторых, время элюции зоны tr в (1 + Кr) раз больше, чем to, а т.к. Vr=tr*v, то удерживаемый объем Vr в  (1 + Кr) раз больше, чем Vo.

      Для лучшего понимания  проиллюстрируем  значение K на описании миграции (хроматографической) зоны.

  

       Миграция зоны

 
        Представьте себе, что в описанную выше колонку с того же кон­ца, где находится исходная хроматографическая зона, начинают подавать элюирующую жидкость. Разумеется, второй конец колонки при этом открыт так, что жидкость между гранулами по всей ее длине приходит в движение. Как поведет себя зона? Будем пока по-прежнему пренебрегать продольной диффузией. На переднем по течению жидкости крае зоны подвижная фаза, покидая область равновесия, начнет поступать в прилежащий участок колонки, где неподвижная фаза еще свободна от вещества. Молекулы последнего начнут диффундировать внутрь гранул неподвижной фазы, и будет устанавливаться новое равновесие между подвижной и неподвиж­ной фазами на этом участке. Распределение между фазами, как и ранее, будет определяться соотношением степеней сродства вещества к каждой из фаз, т. е. коэффициентом распределения К. Зона начнет расширяться, однако концентрация вещества в присоединяющемся спереди участке будет ниже, чем в исходной зоне, так как в этот участок поступает только то количество вещества, которое раньше содержалось в подвижной фазе такого же (по длине колонки) участ­ка. В это же время из точно такого же по длине колонки участка, находящегося в конце зоны, подвижная фаза уходит вперед, а на ее место поступает чистый элюент. И здесь происходит равновесное перераспределение, на этот раз за счет вещества, прежде находив­шегося в неподвижной фазе, которое теперь частично десорбируется. Общая концентрация вещества в этом «арьергардном» участке зоны, очевидно, тоже начинает уменьшаться. В остальных участках, на которые можно мысленно разбить исходную зону, уходящая вперед подвижная фаза замещается точно таким же раствором подвижной фазы, поступающим из расположенных сзади участков, и равнове­сие не нарушается.

      Описанные явления будут развиваться дальше. На следующий по ходу течения жидкости участок колонки будет поступать уже обедненная подвижная фаза, и новое равновесное распределение здесь пойдет в условиях еще меньшей концентрации вещества. В это же время на предыдущем (только что рассмотренном) участке переднего фронта произойдет замена обедненной было подвижной фазы на полноценную, поступившую из исходной зоны, и концентра­ция вещества на этом участке повысится. Тем временем на концевом участке зоны замена уже обедненной подвижной фазы новой пор­цией элюента приведет к дальнейшему снижению суммарного коли­чества вещества. Наконец, соседний, лежащий впереди участок тоже начнет истощаться в результате замены полноценной под­вижной фазы на обедненную, поступившую из концевого участка зоны.       В результате «центр тяжести» зоны сместится вперед, в то время как зона в целом начнет как бы «расплываться». Нам важно как-то оценить эту скорость смещения и характер расширения зоны и представить себе,   как   они    зависят   от   условий   хроматографии.

        Идти дальше по пути словесного описания явлений слишком слож­но, поэтому воспользуемся введенным выше приемом представления хроматографических зон с помощью диаграмм.

 

Рис. 4. Сопоставление характера миграции хроматографических зон для двух веществ, отличающихся между собой по степени   сродства   к  неподвижной   фазе   (см.   текст)

       На рис. 4 слева вверху представлена исходная зона, для которой К = 1 (заштрихованный и незаштрихованный участки диаграммы одинаковы). Описанные выше перераспределения вещества возникают сразу же, как только подвижная фаза начинает покидать исходную зону, и происходят непрерывно. Такую ситуацию наглядно иллюстрировать трудно. Воспользуемся обычным приемом математического анализа. Пред­ставим себе вначале, что процесс идет скачкообразно, а затем будем постепенно уменьшать величины скачков до тех пор, пока не при­близимся (в пределе) к естественному плавному течению хроматографического процесса. Для наглядности «скачки» на рис. 4 выбраны максимальными — на всю ширину хроматографической зоны. Во­образим, что вся подвижная фаза исходной зоны мгновенно пере­мещается на соседний участок колонки (ширина зоны сразу удваи­вается), а затем остается там до тех пор, пока на обоих участках за счет поперечной диффузии не установится равновесие. Результат этого скачка представлен диаграммой во второй строке левого столбца. Легко понять, что для выбранного характера распределе­ния между фазами (К = 1) оба участка будут выглядеть одинаково и на каждом из них будет находиться половина исходного материала зоны, поровну распределенного между неподвижной и подвижной фазами.
 
      Сделаем теперь второй такой же скачок, т. е. мгновенно перемес­тим всю подвижную фазу колонки еще на один объем, равный объему исходной зоны, и снова подождем установления равновесия. Рас­суждая, как описано выше, легко убедиться в том, что теперь зона приобретает форму, представленную третьей строкой левого столб­ца на рис. 4. Предоставим читателю проверить, что, двигаясь таким образом шаг за шагом, можно получить всю серию из восьми распо­ложенных одна под другой диаграмм, наглядно иллюстрирующих миграцию и расширение зоны для нашей еще очень грубой модели хроматографического процесса при К = 1. Стрелками на диаграм­мах отмечены положения центра тяжести зоны, вертикальными ли­ниями — положения ее переднего фронта. Строго говоря, зона рас­тягивается на весь объем от начала колонки до переднего фронта зоны, но при этом на обоих концах зоны оказывается так мало ве­щества (в нашем примере концентрация снижается в 27, т. е. в 128 раз), что реальная хроматографическая зона уходит от начала колонки и отстает от фронта течения элюента.
 
      Теперь выясним роль выбора значения К. В правом столбце рис. 4 представлены результаты аналогичного графического анализа процесса миграции зоны для К = 3. Исходную общую загрузку зоны (высоту столбца диаграммы в первой строке) оставим без из­менения. Уже после первого скачка, как видно из сопоставления диаграмм второй строки, появляется существенное отличие харак­тера трансформации зоны. Теперь она уже отнюдь не однородна, хотя и стала вдвое шире. Подвижная фаза вынесла вперед лишь 1/4 вещества исходной зоны; здесь оно распределяется между фазами также в отношении 1 : 3. Соответственно участок исходной зоны лишился только 1/4 части своего содержимого, и после перераспре­деления вещества со свежей порцией элюента его диаграмма еще не очень сильно отличается от исходной. Проделав аналогичную манипуляцию еще шесть раз, мы приходим к результату, представ­ленному последней строкой правого столбца, который можно сопо­ставить с тем же этапом «элюции» в предыдущем случае. Это со­поставление позволяет сделать важный качественный вывод: с уве­личением степени сродства вещества к неподвижной фазе движение хроматографической зоны замедляется!
   Фундаментальный факт замедления скорости миграции зоны с увеличением К лежит в основе любого варианта хроматографического фракционирования смеси веществ. После анализа, проведен­ного с помощью следующего рисунка, читатель сможет убедиться в том, что скорость миграции центра зоны не зависит от выбора ве­личины скачков модельной системы. Из этого следует, чго сделанный вывод сохраняет свою силу и для реального хроматографического процесса.
      Кривыми в последней строке рис. 4 обозначены сглаженные «профили» зон для двух сопоставляемых случаев хроматографиче­ской элюции. Внизу эти профили совмещены на длине колонки. Такая картина может быть получена при внесении в исходную зону смеси двух веществ с различными коэффициентами распределения (К = 1 и К = 3). Существо проведенного рассмотрения позволяет заключить, что расхождение зон будет тем заметнее, чем сильнее отличаются между собой значения К для двух компонентов смеси или, что то же, чем сильнее они различаются по степени сродства к неподвижной фазе. Проведя соответствующие измерения, легко убедиться в том, что отношение расстояния, пройденного передним фронтом элюента (вертикальная линия), к расстоянию, пройденному центром тяжести зоны (стрелка), если отсчитывать их от начала ко­лонки, для левого столбца (К = 1) равно двум, а для правого (К = 3) постепенно приближается к четырем. Оба эти отношения можно представить в виде суммы 1+ К. Далее мы увидим, что это отнюдь не случайно.

     Тем, кто знаком с методами хроматографии, полученная картина напоминает типичное разделение хроматографических «пиков», достаточно, впрочем, плохое из-за их непомерного расширения. Однако такое расширение обусловлено не существом метода, а лишь несовершенством модели грубых скачков, что не принципиально и будет верно при любой степени дисктности модели.

    При этом величина отставания зоны от фронта элюции останется неизменной — она зависит только от коэффициента распределения вещества между фазами. Таким обра­зом, даже это первое, довольно грубое рассмотрение процесса хрома-тографической элюции позволяет сделать два практически важных заключения. Во-первых, зона вещества будет двигаться вдоль ко­лонки тем медленнее, чем сильнее выражено сродство этого вещест­ва к неподвижной фазе сорбента.         Во-вторых, во избежание расши­рения зоны элюцию надо проводить достаточно   медленно.
      В заключение анализа динамических моделей отметим, что три кривые распределения — суммарного количества вещества вдоль зоны и его количества в неподвижной и подвижной фазах - строго подобны, так как в любом сечении зоны равновесные соотношения между ними определены значением К. Это позволит нам далее гово­рить о форме и характере движения вдоль колонки хроматографической зоны в целом, имея в виду суммарное количество содержа­щегося в ней вещества, тем более что в момент вытекания из колонки (сбора фракций) это вещество выходит в виде раствора суммар­ной концентрации, которая из-за отсутствия в пробирках коллек­тора фракций неподвижной фазы уже никак изменяться не будет. Зона при этом не деформируется, так как судьба впереди идущего, покидающего колонку участка зоны не может повлиять на характер элюции следующих за ним участков.
    Рассмотрим теперь подробнее форму реально мигрирующей зоны, т. е. характер распределения вещества вдоль нее. В нижней части рис. 4 диаграммы, очерчивающие профили зоны, аппроксимированы плавными кривыми. Известно, что реальные хроматографические пики имеют колоколообразную форму.     Теория показывает, а опыт подтвер­ждает, что эта форма может быть хорошо представлена математиче­ской зависимостью, играющей центральную роль в теории статисти­ческих процессов, так называемым «распределением Гаусса». Нам не­обходимо познакомиться с особенностями этой зависимости поближе. 
   

  Распределение Гаусса

Рассмотрим    математическую   функцию   у = f (х)   вида
 
где А — некий постоянный множитель, а — постоянный параметр, е — основание натуральных логарифмов (е ≈2,718) и X'— фикси­рованное значение аргумента х. Легко видеть, что для всех значений х, сильно отличающихся от х', когда модуль разности | х — X'|>> а,величина у →0.
При х = х' функция имеет максимум:  
 

  Наконец, если | х — X'|=а, то:

 

 

    График такой функции представлен на рис. 5. Он представляет собой колоколообразную кривую именно такого вида, какой был рассмотрен выше для огибающей симметричной хроматографической зоны. Если представить себе, что колонка расположена вдоль оси X, а ее начало совпадает с точ­кой х = 0, то рис. 5 иллюстри­рует ситуацию, когда исходная зона продвинулась на расстояние х' и несколько «расплылась».

 Рис.5 Расрпеделение Гаусса.
 
     Выясним теперь смысл пара­метра а и множителя А. Из гра­фика ясно, что величиной а можно характеризовать степень «расплывания» функции (хроматографической зоны). Чем больше а, тем график становится шире и ниже. Если проинтегрировать функцию распределения Гаусса вдоль всей оси X, т. е. определить площадь, ле­жащую под кривой, то получается, что она равна просто А (для того чтобы получить этот удобный результат, в функцию был введен множитель (2п)-0,5). Таким образом, множитель А характеризует площадь под кривой. Замечательно, что результат интегрирования не зависит от а. Как бы ни «расплывалась» кривая распределения Гаусса за счет увеличения а, ограниченная ею площадь остается неизменной. Но это как раз то, что нам нужно для описания мигра­ции хроматографической зоны, если под А понимать суммарное ко­личество вещества в зоне. Величину а принято называть полушириной кривой Гаусса, т. е. характеризовать ширину всей кривой величиной 2а, измеренной на высоте у = 0,607 ymax. Действительно, если надо как-то условиться о характеристике ширины плавной кривой такого вида, то указан­ный выбор можно признать вполне удачным — в симметричный интервал 2а попадает основная часть площади, лежащей под кривой. Кроме того, тем самым практически указывается и максимальная ширина кривой у основания — построение показывает, что ее можно принять равной 4а, пренебрегая малозначащими «хвостами» функ­ции, лежащими вне этого интервала. Размерность а совпадает с раз­мерностью аргумента распределения Гаусса. Для распределения ве­щества вдоль хроматографической зоны — это размерность длины. Для распределения, изменяющегося со временем, а может иметь размерность времени.
    Поскольку кривая Гаусса в теории вероятностей описывает отклонения от среднего значения некоей величины, подверженной флюктуациям, и в частности разброс ошибок измерения, то вели­чину а нередко именуют стандартным отклонением (standard deviation). Квадрат этой величины (а2) называют дисперсией (vari­ance). Нас будет особо интересовать именно дисперсия ввиду сле­дующего замечательного свойства распределения Гаусса, которое можно доказать методами теории вероятностей. Если имеется любое число i физических факторов, влияние каждого из которых на форму распределения может быть учтено и описано величиной аi, то сово­купное воздействие всех этих факторов сохраняет форму распреде­ления Гаусса, для которого величина стандартного отклонения а оказывается   связанной   с ai   зависимостью:
 
    Иными словами, при совокупном воздействии нескольких фак­торов, ведущих к случайным отклонениям от средней величины, суммируются не стандартные отклонения, а дисперсии. Однако мы еще отнюдь не доказали, что профиль хроматографической зоны действительно имеет форму распределения Гаусса. Доказательство такого предположения может быть получено, если удастся записать общее уравнение миграции зоны, учитывающее все физические фак­торы, влияющие на ее форму, решить его и показать, что это решение имеет приведенную выше структуру функции у = f(х). Это действи­тельно удается сделать, как будет показано в следующем параграфе.
 

Уравнение движения хроматографической зоны

    Это уравнение, а тем более его решение достаточно сложны, и приводить их здесь не имеет смысла. Читатель может найти соот­ветствующий материал в фундаментальных монографиях и специальной литературе. Мы ограничимся общими замечаниями о том, как такое уравнение составляют и какие физические параметры реального хроматографического процесса в нем стараются учесть, затем приведем решение этого уравнения и проанализируем вытекающие из него практически важные особенности поведения хроматографиче-ской зоны в ходе ее миграции вдоль колонки.

    При составлении уравнения движения учитывают следующие физические особенности реального хроматографического процесса, приводящие к расширению зоны: 1) неоднородность тока жидкости в подвижной фазе (например, между гранулами могут образовы­ваться каналы, где жидкость течет быстро, или же могут формиро­ваться застойные зоны); 2) продольную диффузию молекул вещества в подвижной фазе; 3) продольную диффузию вещества в неподвиж­ной фазе; 4) неравновесность распределения вещества на границе сорбирующей поверхности в неподвижной фазе; 5) неравновесиость распределения вещества по объему подвижной фазы; 6) неравновес­ность распределения вещества по объему жидкости в неподвижной фазе (внутри гранул или в слое жидкости, сорбированной на их поверхности). Для упрощения записи условимся далее теми же циф­рами обозначать параметры зоны, отражающие воздействие перечис­ленных факторов, т. е. слагаемые суммарной дисперсии зоны. Каж­дый из упомянутых физических процессов является статистическим по своей природе и, действуя отдельно, вызывает расширение зоны, подобно тому как это было показано ранее с помощью диаграмм, где, по существу говоря, объединилось действие всех факторов не­равновесности распределения вещества (факторы 4—6). Воздействие каждого из процессов можно характеризовать величиной обуслов­ленного им стандартного отклонения стг, а их совместное действие приведет к стандартному отклонению а, которое можно подсчитать, суммируя соответствующие дисперсии:

 

      При составлении первого уравнения движения зоны предпола­гают, что в начальный момент времени t= 0 на колонку длиной L вносят в виде очень тонкого слоя конечную массу вещества М и немедленно начинают элюцию так, что подвижная фаза перемещается вдоль колонки с линейной скоростью и, которую условимся называть скоростью элюции. Далее рассматривают бесконечно тонкий слой внутри зоны в момент t, когда максимум ее находится на расстоянии х от начала колонки. Для этого слоя составляют дифференциальное уравнение баланса, имея в виду, что скорость изменения количества вещества в неподвижной и подвижной фазах слоя (суммарно) обус­ловлена разностью потока вещества на границах слоя в обеих фазах с учетом диффузии. В таком уравнении фигурируют две функции, например концентрации вещества в подвижной фазе (Ст) и непо­движной фазе (Cs), и два аргумента, неявно связанные между собой,— х и t. С помощью второго уравнения, описывающего переход вещест­ва из одной фазы в другую, первое уравнение можно преобразовать так, что оно будет записано только для одной функции, например Ст. Интересуясь формой зоны в тот момент, когда она подходит к концу колонки, можно положить х = L. Тогда получается диф­ференциальное уравнение для   Ст = f (t), т. е. описание того, как изменяется концентрация вещества на конце колонки. Можно пред­видеть, что эта концентрация будет равна нулю в течение некоторого времени, пока зона движется по колонке, затем будет нарастать, пройдет максимум и снова упадет до нуля в тот момент, когда зона покинет  колонку. Уравнение удается решить, и его решение действительно имеет вид   распределения   Гаусса:

 

 где Sm— площадь подвижной фазы в сечении колонки, u - скорость элюции, а, аt и tr — некие постоянные интегрирования.

    Физический смысл величины atпока раскрывать не будем, но отметим, что она имеет размерность времени. Символом tr в ходе решения уравнения обозначают следующую комбинацию исходных параметров:

 tr=L(1+K)/u            (9)

где К — коэффициент распределения вещества между фазами. Яспо, что при t << tr, как и при t >> tr, концентрация вещества у конца колонки равна нулю. При t = tr распределение Гаусса имеет мак­симум. Физически это означает, что к моменту времени t = tr мак­симум хроматографической зоны достигает конца колонки. Поэтому время tr мы вправе именовать «временем задержания вещества в ко­лонке» (retention time), или просто «временем элюции», или, как ранее, «временем удержания». Так как за это время зона проходит всю длину колонки L, то для скорости миграции  зоны  (v)  с  учетом  (9) можно записать   выражение:

 v=L/tr=u/(1+K)      (10)

Таким образом, мы приходим к важному заключению о том, что хроматографическая зона мигрирует вдоль колонки со скоростью, в (1 + К) раз меньшей, чем скорость элюции. Выше было показано качественно, что с увеличением К движение зоны замедляется, а на частных примерах даже обнаружилось, что оно замедляется в (1 + + К) раз по сравнению со скоростью движения фронта элюепта. Оказывается, что это соотношение можно получить строго для ре­альных условий хроматографии. Отношение скоростей миграции зоны и элюцпи обозначают символом R и называют фактором за­держки (чем меньше R, тем сильнее выражена задержка):

 

R= v/u= 1/(1 + К)    (11) 

В случае тонкослойной хроматографии это отношение скоростей, или, что то же самое, отношение расстояний миграции пятна ве­щества и фронта элюента, обозначают RF. Величина R будет тем меньше, чем больше К, т. е. чем больше сродство вещества к непо­движной фазе.
Запишем некоторые вытекающие из полученного заключения следствия.

    За время to, очевидно, из колонки выходит вся жидкость, которая исходно находилась между гранулами, т. е. свободный («мертвый») объем колонки Vo. Далее при неизменной скорости элюции и к моменту tr, когда хроматографическая зона достигнет конца колонки, из последней успеет выйти объем жидкости Vr, который можно назвать «объемом элюции» зоны. Из соотношения (2) следует, как описано ранее, что и объем элюции Vr будет в (1 + К) раз больше, чем свободный объем:

Vr= Vo(1 + К)         (12)

С учетом выражения (11) можно записать

Vr= Vо/R                 (13)

    Распределение (8), полученное при решении уравнения движения зоны, описывает ее форму как изменение концентрации вещества на конце колонки во времени. Нагляднее заменить его распределением по длине. Зона движется как целое со скоростью v. Для перехода в уравнении (8) от времен к расстояниям можно воспользоваться следующими соотношениями: tr = L/v, x= t*v. Аналогично вместо параметра at можно ввести параметр а через соотношение at= a/v. Стандартное отклонение а будет точно так же описывать хроматографическую зону, как и at, но уже в единицах длины, т. е. позволит охарактеризовать профиль зоны по длине колонки у самого ее конца. Теперь уравнение (8) с учетом (11) можно записать так:

 
 
      Именно этот вид уравнения позволяет раскрыть значение а через отдельные компоненты дисперсии, фигурирующие в сумме (3). В принятых выше обозначениях при решении общего дифферен­циального уравнения получаются (это нам придется принять на веру) следующие выражения для слагаемых суммарной дисперсии хроматографической зоны: а12= лdL (неоднородность тока жидкости в подвижной фазе); а22 = ymDmL/u (продольная диффузия в подвиж­ной фазе); а32 = ysDsL(1 — R)/Ru (продольная диффузия в неподвиж­ной фазе); а42 = R (1 — R) Lu/x. (неравновесность на сорбирующей поверхности); а52= wd2Lu/Dm (неравновесность в жидкости подвиж­ной фазы); a62 = ed2Lu/Ds (неравновесность в жидкости неподвижной фазы). Здесь л, ym, ys, w, е — постоянные коэффициенты, d — средний диаметр гранул сорбента, Dm— коэффициент диффузии моле­кул вещества в подвижной фазе, Ds— то же, в неподвижной фазе, х — константа   скорости   реакции   десорбции. Каждая отдельная дисперсия вносит свой вклад в суммарную дисперсию, т. е. в расширение хроматографической зоны. Приведен­ные выражения позволяют понять характер влияния выбора пара­метров хроматографического процесса на ширину зоны, т. е. содер­жат в себе очень важную практическую информацию. Например, легко видеть, что с увеличением диаметра гранул зона расширяется как за счет неоднородности тока жидкости, так и особенно за счет неравновесности распределения молекул вещества по объемам по­движной и неподвижной фаз. Эта неравновесность будет сказываться тем меньше, чем больше значения коэффициентов диффузии Dm и Ds, т. е. чем легче диффундирует вещество. С другой стороны облегчение диффузии (увеличение Dm и Ds) влечет за собой расши­рение зоны за счет продольной диффузии (особенно в подвижной фазе). Скорость элюции (u) также влияет двояким образом. С ее уве­личением вклад продольной диффузии в расширение зоны умень­шается, зато сильнее сказываются все неравновесности распределе­ния. Наконец, все факторы без исключения увеличивают дисперсию зоны пропорционально длине колонки L. Отсюда следует, что дви­жение хроматографической зоны вдоль колонки в неидеальных условиях связано с непрерывным расширением зоны. Это должно нас насторожить в отношении целесообразности увеличения длины колонки.

     Необходимо также отметить следующее: поскольку стандарт­ные отклонения суммируются как дисперсии, т. е. в виде квадратов то наибольшее из влияний будет резко доминировать над всеми остальными. Действительно, если, например, одно из отклонений равно 6 см, а второе — 2, то суммарное стандартное отклонение a составит (36 + 4)1/2, т. е. около 6,3 см. Это — очень существенное замечание. Из него следует, что усилия по улучшению характерис­тик колонки должны быть направлены целиком на доминирующий фактор. Очень часто в качестве такового выступает неравномерность тока подвижной фазы, обусловленная разбросом размеров гранул и несовершенством набивки колонки. Особенно неблагоприятная ситуация может складываться у стенок колонки, поэтому ее диаметр должен быть по меньшей мере в 50 раз больше среднего диаметра гранул.

    Очевидно, что должен существовать какой-то оптимум скорости элюции, при котором обеспечивается минимальное расширение зоны. Действительно, построение графика зависимости а2=f(u) дает всегда кривую с минимумом (рис. 6), которому и отвечает оптималь­ная скорость элюции. Практически ее не рассчитывают, а подбирают экспериментально по минимальному расширению хроматографи­ческого пика. Но это не делает наше теоретическое рассмотрение излишним. Оно показывает характер зависимости расширения зоны от скорости элюции. Из рис. 6 легко видеть, что для скоростей, не превышающих оптимальную, дисперсия очень резко (по гиперболическому закону) идет вверх — зона сильно расплывается за счет продольной диффузии. В отличие от этого при скоростях, боль­ших оптимальной, рост дисперсии зоны идет умеренно (по линей­ному закону).

Рис. 6  Зависимость дисперсии зоны от скорости элюции.
   
    Поэтому нередко имеет смысл использовать скорость элюции, в 5—6 раз большую оптимальной, и ценой незначительного расширения зон существенно уменьшить продолжительность опыта, но нельзя допускать, чтобы скорость элюции была намного ниже оптимальной. Это важный практический вывод. Можно показать, что оптимальная скорость элюции оказывается тем больше, чем выше значения коэффициентов диффузии вещества и чем меньше диаметр гранул. Уменьшение диаметра гранул снижает дисперсию зоны, улучшает разрешение пиков (см. ниже), позволяет повысить скорость и сократить время хроматографирования. Однако при этом растет гидравлическое сопротивление колонки, возникает необходимость вести элюцию при повышенном давлении и встают связанные с этим проблемы сжимаемости неподвижной фазы. Подробнее эти вопросы будут рассмотрены ниже; их успешное разрешение привело к бур­ному развитию за последние годы высокоэффективной хроматогра­фии при повышенном давлении.
    Отметим еще, что симметричная гауссова форма хроматографического пика реализуется только в том случае, когда поперечная диффузия и процессы сорбции—десорбции на сорбирующей поверх­ности более или менее успевают обеспечивать равновесное распре­деление вещества между фазами в ходе миграции зоны. Если этого не происходит, например при чересчур быстрой элюции, то форма пика искажается: его передний фронт оказывается крутым, а задний растягивается. Такая картина, нередко наблюдаемая на практике, может приводить к загрязнению последующего пика материалом, выходящим на «хвосте» предыдущего. Наше рассмотрение не толь­ко объясняет причину этого явления, но и указывает способ его устранения — снижение скорости элюции. Уменьшение диаметра гранул, облегчая установление равновесия, также препятствует развитию такого рода дисторсии.
    В современной жидкостной хроматографии при использовании гранул с малым разбросом диаметров и хорошей набивке колонок наибольший вклад в расширение зоны и ухудшение разрешения зачастую вносит неравновесность обмена на сорбирующей поверх­ности. Среди компонентов дисперсии в этом случае преобладает слагаемое а42, которое с учетом (11) можно представить так: а42 = К/(1+K)2*Lu/x. Отсюда следует, что   эта   дисперсия имеет максимум при равномерном распределении (К =1) и снижается по мере того, как распределение сдвигается в сторону неподвижной фазы (К>>1). Однако параллельно увеличивается вклад в дисперсию продольной диффузии в неподвижной фазе, поскольку, как легко видеть, вели­чина a32 растет с увеличением К (уменьшением R). Кроме того, как явствует из выражения (10), существенно замедляется скорость ми­грации. На практике стараются выбрать условия хроматографии так, чтобы значение К не превышало 40—50.
    В проведенном теоретическом рассмотрении было сделано пред­положение, что исходная зона имеет очень малую (точнее, бесконеч­но малую) ширину. На самом деле это не так: начальная зона имеет форму прямоугольника, который, очевидно, не может скачком пре­вратиться в колоколообразную кривую распределения Гаусса. Вначале расширение зоны идет за счет размывания ее переднего и заднего фронтов (рис. 7).

    Рис. 7 Последовательные этапы деформации хроматографической зоны конеч­ной ширины в ходе ее миграции по колонке (схема).
   
    Можно доказать, что профиль каждого фронта может быть описан соответствующей половиной кривой Гаусса. Практически в большинстве случаев аналитического фрак­ционирования хроматографические пики за время прохождения по колонке, расплываясь, успевают принять колоколообразную форму распределения Гаусса, поэтому сделанные выше качественные вы­воды относительно выбора скорости элюции и диаметра гранул со­храняют свою силу и для реального хроматографического процесса.
 

Концепция теоретических тарелок

    Введение понятия «теоретическая тарелка» базируется на том факте, что все шесть слагаемых суммарной дисперсии а2 содержат в качестве множителей длину колонки L. Это позволяет записать для дисперсии простое выражение: а2 = LH, или а = (LН)1/2 , где
    Из формулы (15) следует, что ширина зоны пропорциональна квад­ратному   корню из длины пути миграции зоны вдоль колонки.
    Величина Н характеризует качество колонки (в любом ее сече­нии) в отношении дисперсии хроматографической зоны в данных условиях эксперимента. Так как стандартное отклонение а здесь имеет размерность длины, тоиЯ должно иметь ту же размерность. Чем меньше величина Н, тем лучше работает колонка. В современных колонках добиваются того, что Н = (1 - 2) d, т. е. величине H отвечает размер порядка малых долей миллиметра. Отсюда появи­лось наглядное представление о тонком диске, как бы вырезанном из колонки. Его образно назвали «теоретической тарелкой», а ве­личину Н именуют «высотой теоретической тарелки». Исторически этот термин появился при рассмотрении модели хроматографиче­ского процесса, где непрерывную элюцию заменяли малыми скач­кообразными продвижениями зоны, подобно тому как это было сде­лано выше в методе диаграмм. Кстати, с помощью этого метода понятию теоретической тарелки можно придать наглядный смысл. Как было установлено, с умень­шением ширины гипотетического скачка, описывающего продвиже­ние зоны вдоль колонки, меняется и форма зоны, в частности сте­пень ее расширения. Представим себе, что при хроматографировании определенного вещества в реальных условиях мы эксперимен­тальным путем нашли закон расширения зоны, а затем подобрали ширину теоретического скачка так, чтобы расширение, описываемое методом диаграмм, следовало бы точно такому же закону. Ширина этого скачка и отвечает понятию высоты теоретической тарелки Н. В методе диаграмм мы не принимали во внимание продольной диффузии, однако можно себе представить, что существует более сложная модель скачкообразного движения зоны, учитывающая все факторы, ведущие к размыванию зоны. Ширина эквивалент­ного скачка в этой модели может служить наглядной иллюстрацией понятия о величине Н. Впрочем, всегда лучше остерегаться наглядных аналогий и не упускать из виду реальный смысл тех или иных понятий. Лучше считать, что высота теоретической тарелки Н — это просто пара­метр хроматографического процесса, учитывающий совокупность ряда физических факторов, размывающих зону, а его размерность совпадает с размерностью   длины. Следует подчеркнуть, что высота теоретической тарелки харак­теризует отнюдь не только саму колонку. Из параметров собственно колонки на величину Н явным образом влияет диаметр гранул (d), а неявным — коэффициент л, значение которого сильно зависит от степени однородности набивки колонки. Однако, кроме этих пара­метров, высоту Н определяют и выбор скорости элюции (u), и харак­тер диффузии вещества в обеих фазах (Dm, Ds),и распределение ве­щества между зонами (R), и кинетика сорбции (х). Таким образом, для разных препаратов или при разных условиях элюции одна и та же колонка может характеризоваться различными значениями Н. Нередко для характеристики качества хроматографического процесса пользуются термином «число теоретических тарелок» (N), под которым подразумевают отношение длины колонки к вы­соте тарелки:

N = L/Н             (16)

    Ниже будет показано, что это отношение определяет разрешающуюспособность данного хроматографического процесса —именно про­цесса, а не только самой колонки. Подчеркиваем это еще раз, для того чтобы читатель критически относился к рекламным данным многих фирм, утверждающих, что выпускаемые ими колонки имеют столько-то тысяч теоретических тарелок, не указывая при этом, для каких веществ и в каких условиях элюции подсчитаны эти тысячи. Число теоретических тарелок легко оценить по результатам хроматографического эксперимента. Подставив в (16) выражение для а = (LН)1/2, можно записать:
 
    Вместо полуширины а удобнее использовать полную ширину пика у его основания (W). Выше было отмечено, что для распределения Гаусса W ≈4а, тогда:

N = 16(L/W)2   (18)

    Выше мы обозначили скорость движения хродттографической зоны по колонке символом v. Очевидно, что продолжительность выхода пика вещества из ко­лонки tp =W/v. За это время элюент вытекает из колонки со ско­ростью и. Отсюда следует, что VP = Wu/v. Продолжительность миграции хроматографической зоны вдоль длины колонки tL =L/v, а объем элюции  Vr= Lu/v. Теперь можно подставить в (18) выражения L = Vrv/u и W = Vpv/u и получить практически удоб­ную формулу для определения числа теоретических тарелок:

N = 16(Vr/Vp)2 (19)

    Иногда в целях получения более концентрированного раствора очищенного вещества предпочитают отобрать не весь пик, а ту (основную) его часть, которая лежит между ординатами, соответст­вующими половине высоты пика. Если объем этой части обозначить F0,5, то выражение (19) с учетом формы распределения Гаусса изме­нится на аналогичное, но с другим коэффициентом:

N = 5,54(Vr/V0.5)2         (20)

    Вместо объемов в формулы (19) и (20) можно подставить соот­ветствующие времена: время задержания зоны на колонке и про­должительности выхода всего пика или основной его части. Остается добавить, что все эти измерения и расчеты будут более или менее корректными, если объем исходной зоны мал по сравнению с  объемом выходящего пика (практически этот объем обусловлен именно неидеальностью хроматографического процесса). Так будет в том случае, когда количество исходного материала невелико и он хо­рошо сорбируется  в верхней части колонки.
 

 Разрешение близко мигрирующих зон

    Уже отмечалось ранее:"Процессы удерживания и размывания - предмет теории хроматографии." Целью же хроматографического эксперимента, в аналитическом его варианте, является разделение («разрешение») в ходе миграции вдоль колонки или пластинки хроматографическнх зон, содержа­щих чистые компоненты фракционируемой смеси веществ. Эти зоны или (в случае широких зон) их передний и задний фронты имеют форму кривых распределения Гаусса. Естественно задать вопрос: при каком минимальном расстоянии между зонами разрешение можно    считать   удовлетворительным?

Обозначим Ãх расстояние между максимумами двух соседних зон, описываемых распределением Гаусса (рис. 9). Разрешением (Rs) двух  таких  зон   называют следующее  отношение:

 
     Или, принимая во внимание, что ширина пика у основания w приближенно равна как раз 4а, то можно выразить Rs следующим образом:
 
    Так как ширина кривой Гаусса у основания приближенно равна как раз 4а, то полуширина зоны (или ширина фронта широкой зоны у ее основания) равна 2а. Для двух соседних зон величину стандарт­ного отклонения а можно считать одинаковой, поэтому минимальное значение разрешения, при котором зоны можно физически разде­лить, равно единице (Rs= 1). Можно показать, что при этом вза­имное загрязнение зон (одинаковой амплитуды) за счет «хвостов» кривых Гаусса составляет примерно 2,3%.

Рис. 8  Расстояние между узкими хроматографическими  зонами, мигрирую­щими по  колонке  (слева направо).

 

Найдем зависимость разрешения от параметров хроматографи­ческого процесса. На рис. 8 показаны две соседние зоны, макси­мумы которых в некий момент времени t (считая от начала элюции) мигрировали на расстоянии х1 и х2. Если скорости их миграции обозначить v1 и v2, а факторы задержки (см. формулу 11) — соответ­ственноR1и R2 очевидно, что Ãх = х2 — хг =v2t-v1t= ut (R2— R1) = utÃR. В среднем для двух близких зон можно считать, что ut= vt/R= x/R. Тут и далее R=(R1+R2)/2. Таким образом, Ãх = xÃR/R. К концу колонки (х = L) расхождение зон достигает максимума:
  
Таким образом, расхождение максимумов зон к концу миграций пропорционально длине колонки, степени различия в сродстве двух веществ к неподвижной фазе (ÃR), и тем больше, чем меньше R. т. е. чем сильнее само это сродство. Формулу (21) для разрешения с учетом а = (LН)1/2 теперь можно записать так:
  

  Отсюда следует, что разрешение близких зон пропорционально квадратному корню из длины колонки. Этого следовало ожидать, поскольку одновременно с расхождением максимумов зон (пропор­ционально L) происходит их расширение (пропорционально L1/2). Таким образом, если мы хотим вдвое улучшить разрешение сосед­них зон, придется увеличить длину колонки в четыре раза.

Из формулы (23) следует, что улучшать разрешение эффективнее не за счет длины колонки, а за счет выбора хроматографической системы, обеспечивающей более выраженное различие сродства двух веществ к неподвижной фазе. Следует подчеркнуть, что если хроматографическая система разделения близких зон отработана на ма­лой колонке, то при переносе ее на колонку большего размера сле­дует увеличивать объем только за счет ее диаметра, оставив подоб­ранную длину колонки неизменной. Скорость элюции (мл/ч) следует повысить пропорционально увеличению площади сечения колонки, с тем чтобы линейная скорость течения подвижной фазы (или, что то же самое, расход элюонта в расчете на 1 см2 площади сечения ко­лонки) оставалась неизменной.
Выражение (23) можно записать, используя N — число теорети­ческих тарелок: Rs= 1/4N1/2ÃR/R. Отсюда видно, каким образом число теоретических тарелок характеризует разрешающую способ­ность   хродгатографического   процесса.
До сих пор мы считали зону чисто гауссовой, молчаливо пренеб­регая протяженностью исходной зоны и как следствие возможностью наличия «площадки» на профиле мигрирующей зоны (рис. 9).
 
 
Рис. 9. Расстояние между широкими хроматографическимии зонами с «пло­щадкой»

    Ширина переднего и заднего фронтов зоны у ее основания равна 2а, и если к концу колонки близкие соседние зоны еще сохранят пло­щадку шириной эпсилон, то минимальное расстояние между зонами, отве­чающее их разрешению, будет составлять Ãх = 4а + эпсилон. В препа­ративных вариантах хроматографии бывает, что эпсилон >> а. В таких слу­чаях расширение фронтов зон можно не учитывать, а условие раз­решения записать проще:Ах>=эпсилон. Разрешение в этом случае лучше представить себе как R'=Ах/эпсилон. Оно пропорционально длине колон­ки (за счет Ах), а не корню из ее длины.

    Для характеризации разрешения в литературе приводят еще одну сравнительную термодинамическую характеристику двух разделяемых пиков ве­ществ - относительное удерживание

   или селективность. Эта величина показывает способность данной хроматографической сис­темы разделять данную пару веществ x и y.
 
    Времена удерживания и все производные от них величины являются по существу термодинамическими характеристиками процесса. Однако, в хроматографии (как в любом химическом процессе) результат определяется совместным влиянием факторов термодина­мического и кинетического типа. Если в хроматографической системе данного состава при данной температуре у двух веществ значения tR одинаковы (или α=1.0), то никакое измене­ние геометрии колонки не приведет к разделению этой пары. Но, с другой стороны, различие значений tR вовсе не означает автоматически, что разделение, а тем более хорошее, будет достигнуто. Для этого используемая колонка должна обладать достаточно высокими кинети­ческими характеристиками. Акты сорбции-десорбции должны совершаться с большой ско­ростью, чтобы реализовать потенциальную возможность разделения, на которую указывает различие в tR.
 
    Совместное влияние селективности, удерживания и эффективности на результат раз­деления можно проиллюстрировать наглядно (рис. 10).

 

 
Рис. 10. Совместное влияние селективности, удерживания и эффективности на результат раз­деления.