Определение качества упаковки гель-фильтрационных колонок с сорбентами на основе силикагеля и сверхсшитой агарозы

Аналитическая гель-эксклюзивная хроматография (size exclusion chromatography) очень широко распространенный метод для качественного и колличественного анализа состава сложных смесей различного происхождения. Как известно гель-фильтрация основана на распределении молекул аналита по их размерам и принципиально отличается от всех остальных видов хроматографий тем, что аналит не сорбируется (не должен) на сорбенте, т.к. распределение молекул происходит во время их движения сквозь слой пористого сорбента. Таким образом, в данном виде хроматографического распределения особенно важным (потому что он единственно значимый) свойством колонки является качество упаковки сорбента, естественно, при прочих равных: марки сорбента, размера колонки и т.д. Основными характеристиками колонки являются: мертвый объем колонки - объем элюента между частицами сорбентами и полный объем колонки. Основным свойством сорбента является его пористость, отвечающая за диапазон молекул, которые возможно разделить. В результате все молекулы, превышающие данный диапазон элюируюутся одним пиком в мертвом объеме, а все молекулы с меньшим размером - в самом конце хроматографии при прохождении полного объема колонки (естественно только в том случае, если условия подобраны правильно и не происходит неспецифической сорбции). Но это в теории, а теперь к практике:).

В связи с тем, что в новую лабораторию хроматограф нам купили, а про колонки немного забыли, то достаточно продолжительное время пришлось работать на старых, одолженных колонках. Естественно об их состоянии кроме того, что "они когда-то работали" не было известно ни чего, причем это "когда-то" иногда исчислялось годами. Но тем интереснее:)

Первой колонкой была довольно древняя колонка Bio-Sil SEC 125 Column фирмы Bio-Rad 7.8*300 мм. Исходя из того, что "главное" это качество упаковки, то я решил провести ацетоновый тест. Вообще, стандартно для гель-фильтрационных колонок с силикагелевым сорбентом советуюут использовать витамин В12, но... новая лаборатория. Но, казалось бы, чем плох ацетон? Он гидрофильный, матрица - тоже, а буфер водно-солевой. 

Как оказалось, не вст так просто: при использовании колонки вместе с предколонкой получился очень растянутый пик. Снял предколонку - пик получился менее растянутым.

Сравнение хроматограмм ацетона при использовании колонки Bio-Sil SEC 125 с (правый пик) и без (левый пик) предколонки.

Как хорошо видно из рисунка пик ацетона все равно достаточно сильно "хвостит" даже при отсутствии предколонки. И можно было сделать вывод о том, что колонка не пригодна для использования, но у меня уже был опыт использования ацетона и силикагелевой колонки при нормально-фазовой хроматографии, когда ацетон задерживался. Конечно не показательно, но решил провести еще один тест, использовав уж точно гидрофильный маркер - глицин. Результат на рисунке.

Хорошо видно, что пик глицина имеет удовлетворительную  симметрию и достаточно хорошую эффективность. Таким образом, предположение о сорбции ацетона в водном буферном растворе на силикагелевом сорбенте было косвенно подтверждено, а качество упаковки оказалось удовлетворительным.

Сравнение хроматограмм: альбумина (синий), глицина (розовый) и ацетона (черный) при использовании колонки Bio-Sil SEC 125

Форма пика, полученная при проведении хроматографии раствора человеческого альбумина подтвердила, что с колонкой все нормально и глицин возможно использовать в качестве теста для проверки силикагелевых гель-фильтрационных колонок.

Следующей колонкой, используемой мной, оказалась TSK-GEL G3000SW. Колонка тоже со сложной и малоисследованной судьбой, так что было необходимо провести тест качества упаковки. Но в данном случае использовался солевой буфер с содержанием 25% изопропанола. Тестирование проводилось как ацетоном, так и глицином.

Как видим из представленного рисунка, хроматограммы глицина и ацетона практически идентичны, хотя пик ацетона немного отстает. Но это мелочи, т.к. форма пиковпочти  идентичная, и как показал последующий анализ белков данная форма пика полностью характеризует качество упаковки сорбента: все другие аналиты тоже "хвостили".

Таким образом, предварительно можно сказать, что ацетон можно использовать для тестирования качества упаковки упакованных силикагелем только при использовании солевых буферов с содержанием растворителей. Глицин же более универсален и тем самым более предпочтителен.

Следующей колонкой была Superose 12 10/300 GL фирмы GEhealthcare. Как ясно из названия в ней испльзуется сорбент на основе сверхсшитой агарозы - Superose 12. Стандартов для гель-фильтрации опять не было, но для всех сорбентов на основе полимеризованных сахаров стандартным является именно ацетоновый тест, который я и провел, но после, я уже из интереса, вколол и стандарт глицина, ожидая, что элюция пройдет одновременно. Результат сильно меня удивил (см. рисунок).

Сравнение хроматограмм образцов глицина (розовый) и ацетона (синий), полученных при хроматографии в водно-солевом буфере Superose 12 10/300 GL.

Показано, что:

1. ацетон опять вышел позже глицина, причем порядочно;

2. формы пиков идентичны;

3. обратный пик воды, видный на хроматограмме глицина, регистрируемой при 210 нм, находится ровно между пиками аналитов.

Как это объяснить, исходя из общепринятой парадигмы, что ацетон не взаимодействует со сверхсшитой агарозой (да и формы пиков-то одинаковые!) - я пока не понимаю. Хотя я также не совсем понимаю: зачем это понимать?:)

Но, в то же время, ведь надо же, наверное, стараться как можно лучше знать прибор с которым работаешь? 

Всем удачи, счастья и как можно больше разгаданных загадок в Новом году.

AttachmentSize
BioSil columns.pdf27.84 KB
TSK Gel columns.PDF55.69 KB
Superose 12.pdf344.01 KB
Anatoly's picture

SEC

 Глицин по размеру больше ацетона, так что должен выходить первым, кроме того для колонок от GE  рекомендуются растворы содержаие минимум 150мМ хлорида натрия, что бы предотварить pH dependent interaction, , так что полярные взаимодествия будут иметь место в той или иной степени, 

Василий's picture

Во первых,

Во первых, конечно, я использовал не воду и буфер содержал хлорид натрия в нужной концентрации и pH был в районе нейтрального.
Во-вторых, колонка рассчитана на разделение веществ с Мr более 1000 Да и все вещества меньшего размера должны (по теории) идти или одним пиком, или частоколом, но уж ни как не с разрешением в 4 мин ( 2мл.) В приведенной брошюре даже пик Vitamin B12 с Mr=1355 выходит в районе 20 мл, т.е. в моем масштабе - 40 мин. Там же где и пик ацетона у меня на хроматограмме. А тут различие между веществами с Мr 75 и 58, и разве, оно, должно выливаться в 4 минуты в различии времени выхода?
К тому же, почему-то отрицательный пик воды находиться между данными пиками, хотя у нее, понятно, Mr меньше всех.
Вообщем элементарных ошибок я не сделал, а вопрос, к сожалению, остается без ответа.

Nadia's picture

Добрый день,

Добрый день,
Мне предстоит работа с колонкой Superose 12 10/300 на системе ВЭЖХ Agilent , а опыта работы с  колонками такого рода (упаковки) почти нет. У меня такой вопрос: влияют ли манипуляции с адаптером (разблокировка) на эффективность колонки, и в каком случае они производятся? Буду благодарна за разъяснение.

О пользователе

Василий's picture
User offline. Last seen 29 weeks 3 days ago. Offline
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Joined: 20/05/2009