Ионообменная хроматография

Этот процесс сходен с адсорбционной хроматографией в следствии того, что задержание молекул вещества в неподвижной фазе обусловлено их связыванием с поверхностью твердого гидрофильного материала сплошных или пористых гранул, находящихся в контакте с жидким элюентом. Однако в этом варианте хроматографии задержание происходит не за счет молекулярной адсорбции, а в результате электростатиче­ского   взаимодействия   разноименно   заряженных   ионов.

На всех   наружных и внутренних поверхностях твердых гранул  вдоль нитей полимеров и гелей, образующих пространственную сетку, более или менее равномерно распределены ковалентно связан­ные с этими поверхностями ионогенные группы. В омывающем их водном элюенте они диссоциируют, образуя сетку одноименно заря­женных неподвижных ионов. Если молекулы компонентов фракци­онируемой смеси тоже способны ионизироваться при растворении, причем так, что их суммарный заряд имеет противоположный знак, то они связываются с неподвижными ионогенными группами силами электростатического взаимодействия, оказываясь тем самым фиксированными в неподвижной фазе. Связь эта обратима: ионы одних компонентов могут замещаться на другие или вытесняться находящимися в элюенте контрионами ионогенных групп сорбента, а также специально вводимыми для этой цели в элюент ионами. Происходит обмен ионов, поэтому сорбенты описанного типа называ­ют  ионообменниками (ионитами).

Выбор ионообменного сорбента  для очистки белка в зна­чительной степени зависит от изоэлектрической точки белка — pi. При значениях рН, превышающих pi белка, его молекулы приобретают в целом отрицательный заряд и способны адсорбироваться анионным обменником. При рН ниже pi белок будет адсорбироваться катион-ным обменником. Например, если pi = 4, то в большинстве случаев целесообразно подобрать сорбент, который способен связывать белок при рН > 4. Поскольку при рН > 4 такой белок заряжен отрицательно, то сорбент должен быть анионообменником, например, с диэтиламиноэтильной функциональной группой (ДЭАЭ). Можно было бы использовать рН < 4 и катионообменник, но многие белки в таких условиях нестабильны, либо образуют агрегаты. Если, напротив, белок, который мы хотим очистить, имеет pi = 10, то он будет заряжен поло­жительно в условиях, пригодных, как правило, для ионообменной хро­матографии, т. е. при рН около 7. Таким образом, в общем, для белка такого типа мы должны выбрать катионообменный сорбент, например, с карбоксиметильной функциональной группой (КМ), которая при нейтральном рН заряжена отрицательно.

 
 
Адсорбирующая способность сорбента сильно зависит от рН и от pi разделяемых белков (рис. 1), но также от качества сорбента, прилагаемого давления и от числа прогонов колонки. Чтобы увеличить срок службы сорбента, его следует тщательно промыть, хранить в подходящем растворителе и не применять рН и давле­ние вне предписанных допустимых пределов.

Рис. 1. Зарядовые свойства анионо- и катионообменников. Анионообменник с ДЭАЭ имеет значительную емкость при низких и средних значениях рН=1-6; катионообменник с КМ имеет высокую емкость при высоких и средних значениях рН=6-14.
 
На представленном рисунке показаны профили сил удерживания т.н. "слабых" ионообменников, емкость которых значительно зависит от рН подвижной фазы. Также широко распространены "сильные" катионообменники, практически не меняющие  свою емкость в широком диапазоне рН. В этих ионитах в качестве ионогенных групп используются или остатки сильных кислот (например, серной) в катионообменниках, или  сильные основания (например, четвертичные амины) в анионообменниках. В первом случае катионообменник имеет рабочий интервал рН равен 1-14, а во втором случае - 1-11. На практике при выборе силы обменника следует учитывать множество факторов, например крупные белковые молекулы могут в неподходящих условиях необратимо связываться с "сильными" анионитами.
Разрешающая способность хроматографического разделения зависит преимущественно от типа биомолекул, типа и качества сорбента, ионной силы градиента при элюции, от температуры и от геометрии колонки.
Как уже отмечалось, возможность фракционирования компонентов смеси веществ обусловлена здесь различием в значениях их суммарных зарядов. Последние зависят как от числа и характера ионогенных групп в молекулах, так и от полноты их диссоциации, которую можно контролировать путем выбора рН и ионной силы элюента. Чем боль­ше в данных условиях элюции суммарный заряд того или иного компонента смеси, тем сильнее его взаимодействие с ионообменником и тем медленнее он мигрирует вдоль колонки. Так, на рисунке 2 представлен пример разделения аминокислот, имеющих разный заряд.
 
Рис.2 Разделение имеющих разный заряд аминокислот.
 
На очерченный здесь основной процесс ионообменной хроматографии влияет ряд дополнительных факторов. Среди них, кроме уже фигурировавшей ранее затрудненной (особенно для крупных молекул) диффузии внутри гранул, следует назвать возможность неионной адсорбции на поверхности матрицы ионообменника. Однако при правильном выборе материала обменника, и в частности его пористости, основ­ную роль в процессе фракционирования играет явление ионного обмена.
Схема типичного прибора для ионообменной хроматографии представлена на рисунке 3.
 
Рис. 3 Типичная установка ионообменной жид­костной хроматографии для очистки белков. После загрузки образца насос создает солевой градиент для элюции образца.