Добро пожаловать


• Вход  • Регистрация
• Забыли пароль?

Обратная связь

О фирмах

Разделы

Сорбенты

Детекторы для жидкостной хроматографии

 

 

Наиболее существенным в развитии хроматографического приборостроения,  за последнее время, является стремительное расширение разработок и выпуска жидкостных хроматографов при дальнейшем совершенствовании и устойчивом увеличении выпуска газовых хроматографов.

Все более популярным становится метод высокоэффективной ЖХ (ВЭЖХ), причем развитие метода происходит значительно быстрее, чем предшествующее развитие метода ГХ. Это связано со следующими причинами. Анализ на основе метода ВЭЖХ может быть экспрессионным (10—12-компонентиая смесь анализируется в среднем за 10 ... 15 мин или быстрее); чувствительность метода достигает 10-9 ... 10-10 г/мл (в пределе до 10-12 г/мл); объем вводимых проб составляет не более 10 ... 100 мкл; метод экономичен.

Основные типы детекторов для ЖХ

 

Фотометрические детекторы

Ультрафиолетовый детектор

Рефрактометрический детектор

Интерферометрический детектор

Флуориметрический детектор

Электрохимические детекторы

Вольтамперометрический детектор

Потенциометрический детектор

Полярографический детектор

Кулонометрический детектор

Детектор радиоактивности

Детектор по светорассеиванию
 

В ходе развития ЖХ было предложено большое количество методов детектирования. Существует уже более 20 типов детекторов для ЖХ. Классификация показывает, что основную массу предложенных детекторов можно разложить на следующие классы: оптические, электрические, электрохимические и детекторы для измерения радиоактивных веществ.

К оптическим детекторам относятся ультрафиолетовый (УФД), инфракрасный (ИКД), рефрактометрический (РМД) и флуорометрический (ФМД), а также все детекторы, в которых в той или иной мере используется лазерное излучение, такие как детектор светового рассеяния (СРД), фотоакустический (ФАД), фотокалориметрический (ФКД), фотоионизационный (ФИД) и поляризационный (ПОД) детекторы.

К электрическим детекторам обычно относят детектор по диэлектрической постоянной (ДПД), акустический (АД), емкостный (ЕМД), детектор тока потока (ТПД) и некоторые другие.

Отдельно рассматривается использование в качестве детекторов для ЖХ различных приборов физико-химического анализа, таких как масс-спектрометр (МС), атомноабсорбционный спектрометр (ААС), поляриметр (ПОД), УФ-, ВИД- и ИК-спектрофотометры и газохроматографических детекторов, таких как ДЭЗ, ДПИ, ДПФ, ДТИ и др. 

Тип

Предел детектирования, г/мл

ЭХД

10-12

ФМД

10-11

УФД

10-10

СПФ

10-9

МС

ЭПД

10-7

РМД

Наиболее распространенными детекторами в ЖХ являются оптические детекторы, которые можно разделить на следующие классы:

абсорбционные,  работающие в  УФ-области  спектра  (190 ... 380 нм), — УФД.

абсорбционные для видимой области спектра (380 ... 800 мм) -ВИД;

ИК-детекторы (800 ... 5000 нм) — ИКД;

рефрактометрические различных типов — РМД;

эмиссионные, флуориметрические различных конструкций — ФМД;

хемилюминесцентные — ХЛД.

 

Фотометрические детекторы

  Наиболее часто в ЖХ применяются фотометрические детек торы, основанные на измерении поглощения (абсорбции) света в УФ- или видимой областях спектра. Это связано с тем, что большинство химических соединений имеют достаточно ин тенсивные полосы поглощения в диапазоне длин волн 200 ... 800 нм. Наличие подходящих растворителей, прозрачных в этом диапазоне длин волн, делает фотометрические методы наиболее подходящими для градиентного элюирования.

Фотометрические детекторы имеют достаточно высокую чувствительность для поглощающих УФ- и видимый свет веществ, высокий динамический диапазон линейности (до 106), малый рабочий объем ячеек (<1 мкл), небольшое экстраколоночное расширение пиков и высокую воспроизводимость показаний. Они являются недеструктивными и относительно нечувствительными к колебаниям потока подвижной фазы и изменениям температуры, достаточно удобны в работе и обеспечивают возможность выбора длин волн.

Ультрафиолетовый детектор

Чувствительность современных УФД может доходить до 0,001 е. о. п. на всю шкалу при  1 % шума и зависит от природы анализируемого соединения и длины волны детектирования этого соединения. При такой высокой чувствительности могут быть зафиксированы малые количества (до нескольких нанограммов) слабо абсорбирующих УФ-свет веществ. Широкая линейная область УФД позволяет анализировать как примеси, так и основные компоненты на одной  хроматограмме.

Фотометрические детекторы в свою очередь подразделяются на детекторы с фиксированной длиной волны (УФД), детекторы со сменной (с помощью фильтров) длиной волны, или фильтровые фотометры (ФУФД), и спектрофотометрические детекторы с детектированием в определенной области длин волн (СПФ).

Наиболее простые и дешевые УФД широко применяются в высокоэффективных жидкостных хроматографах, особенно в при борах, предназначенных для массовых рутинных анализов.

При использовании Hg-лампы низкого давления, обладающей высокой стабильностью и долгим временем жизни (более 5000 ч), детектирование проводится на длине волны 254 нм, которой соответствует  90%  энергии излучения. На длине волны254 нм высоким поглощением обладают многие органические соединения, такие как ароматические, гетероциклические, кетоны и т.п.

Наиболее часто для УФД применяются ячейки следующих размеров: длина оптического пути 10 мм, диаметр светового канала около 1 мм, рабочий объем ячейки около 8 мкл. Такие ячейки подходят главным образом для аналитических колонн внутренним диаметром 4 ... 6 мм, заполненных сорбентом с частицами около 5 мкм. Рабочий объем ячейки — это один из важнейших ее параметров. Например, использование ячейки объемом 8 ... 10 мкл может привести к дополнительному размыванию пика на 30 ... 50 мкл и может оказаться неприемлемым для пиков шириной менее 100 мкл. Уменьшение объема ячейки может быть достигнуто двумя путями: сокращением длины оптического пути, что приводит к падению чувствительности детектора, и уменьшением диаметра канала ячейки, которое приводит к снижению интенсивности проходящего через нее света и увеличению шума. Оба эти эффекта увеличивают предел детектирования. Для сверхкритической флюидной хроматографии (СКФХ) необходимы проточные ячейки высокого давления. Оптические детекторы в целях компенсации фона чаще всего имеют две ячейки: рабочую и сравнительную. Для двухканального детектирования используются следующие методы, подключения сравнительных ячеек:

статический при заполнении  сравнительной ячейки чистым растворителем;

динамический путем разделения потока от насоса на две части и пропускания одного из них через рабочую, а другого — через сравнительную колонку и сравнительную ячейку;

динамический с использованием дополнительного насоса низкого давления для прокачивания ячейки тем же растворителем;

динамический путем включения сравнительной ячейки между сосудом с растворителем и насосом в зоне всасывания, а рабочей ячейки — после разделительной колонки.

Спектральный диапазон и степень его разделения на поддиапазоны зависит от спектральной характеристики источника из лучения и от способа выделения необходимой спектральной полосы, осуществляемого или до измерительной ячейки или после нее. Некоторые источники излучения имеют линейчатый спектр (например, ртутная лампа — 254; 303; 313; 365; 464; 436; 516 нм и т.д.), другие — непрерывный спектр (например, дейтериевая лампа — 190 ... 600 нм). Интенсивности их излучения в пределах рабочего диапазона приблизительно одинаковы. Необходимая спектральная полоса выделяется двумя различными способами: с помощью дифракционных решеток, имеющих 1000 ... 3000 штрихов на 1 мм, и интерференционных фильтров с заданной шириной спектральной полосы. В обоих случаях может быть получена спектральная полуширина от 1 ... 2 нм до 10 ... 20 нм.

Способ дискретизации спектрального диапазона в фотометрических детекторах определяет различие между спектрофотометрами и фильтровыми фотометрами для ЖХ.

Следует иметь в виду, что СПФ, обеспечивающие возможность многоволнового детектирования, очень дороги. Для дешевых приборов массового анализа необходимо сочетать возможность работы на нескольких длинах волн с низкой стоимостью детектора, что обеспечивается применением фильтрового фотометра.

Характерной особенностью многих фильтровых УФД является использование в них источников линейчатого спектра. Кроме ртутной применяются кадмиевая и цинковая лампы с линиями на 229 и 214 нм соответственно. Используются также преобразователи излучения с длиной волны λ = 254 нм в излучение с λ = 280 ... 290 нм и в другие длины волн, отсутствующими в спектре ртути.

Особый интерес представляют разработанные в последнее время фильтровые фотометры с дейтериевой лампой в качестве источника излучения. В них используется принцип выделения в УФ-области спектра достаточно широких полос (около 10 нм) из непрерывного спектра источника с помощью широкополосных интерференционных фильтров. Этот принцип применяется также в флуориметрии и спектроскопии в видимой области. Характеристики таких фотометров достаточно высоки. Выводы о более высоком уровне шумов при использовании фильтровых УФД по сравнению с шумами приборов с источниками линейчатых спектров справедливы в случае узкополосных интерференционных фильтров, так как доля энергии,-приходящаяся на узкую (1 ... 2нм) полосу непрерывного спектра, значительно ниже энергии наиболее интенсивных полос, например, ртутной лампы.

Применение широкополосных фильтров позволяет получить примерно на порядок более интенсивный световой поток. Уровень шумов значительно снижается. Достигается перекрытие достаточно широкого диапазона длин волн с помощью всего 4 ... 6 интерференционных фильтров. При этом наблюдается некоторое снижение селективности детектирования по сравнению с селективностью СПФ, но, учитывая большую ширину полос (30 ... 40 нм), характерную для электронных спектров поглощения молекул, этот эффект можно не учитывать.

При сравнении фильтровых фотометров с СПФ низкого разрешения предпочтение также отдается первым вследствие простоты их оптической схемы без множества отражающих поверхностей, существенно ослабляющих световой  поток в СПФ.

В настоящее время наблюдается тенденция использования фильтровых фотометров для многоволновой записи хроматограмм — метода, который ранее считался областью применения только дорогостоящих сканирующих спектрофотометров.

Учитывая изложенное выше, можно заключить, что применение УФД с дейтериевой лампой в качестве источника света и набором широкополосных фильтров с целью создания относительно дешевого двух-, трех- и четрехволнового УФД с выбором длин волн в диапазоне 200 ... 300 нм является самым распространенном.


 

Рис. 1. Оптическая схема двухканального УФД с фотодиодной матрицей:

1 — источник света; 2 — щелевая линза; 3 — проточная ячейка; 4 — щель; 5 — решетка; 6 — зеркало; 7 — фотодиодная матрица; 8 — селектор длин волн; 9 — дифференциальный   усилитель;   10 — самопишущий   прибор.

Другим перспективным направлением является применение фотодиодных матриц для регистрации всего спектра (Рис. 1). В СПФ с фотодиодной матрицей непрерывное излучение источника света проходит через проточную ячейку 3 и попадает на дифракционную решетку 5. Луч отклоняется и фокусируется на плоскости фотодиодной матрицы 7, состоящей из 200...500 элементарных фотодиодов, которая выдает информацию сразу обо всем диапазоне длин волн с дискретностью 2...5 нм. Постоянная времени системы с 200 фотодиодными элементами должна быть не более 40 нс. В связи с тем, что при регистрации спектра в диапазоне длин волн 200...600нм создается массив информации около 1000 К для аналитической хроматографии и около 5000 К для микроколоночной ВЭЖХ при ширине пика на половине высоты менее 1 с, обработка и запись спектров проводится с помощью быстродействующих компьютера и регистратора.

 Совместное использование детекторов нескольких типов в единой системе, например УФД с инфракрасным (ИКД) и рефрактометрическим (РМД) детекторами, значительно увеличивает информативность анализа в результате одного разделения, особенно при идентификации таких соединений, как насыщенные, ненасыщенные, разветвленные и ароматические углеводороды. Примером может также служить применение управляемого компьютером градиентного жидкостного хроматографа с УФД, ФМД и когерентным рамановским спектрометром в качестве детектора, объединенными в единую систему около одной ЭВМ.

К фотометрическим детекторам относится также детектор, основанный на поглощении света в ИК-области спектра (ИКД). Некоторые функциональные группы органических соединений имеют характеристические частоты в ИК-спектрах этих соединений. Поэтому ИКД может служить для идентификации природы органических соединений. Одним из основных условий работы ИКД является  прозрачность применяемых растворителей в ИК-области спектра. Наиболее подходящими, однако редко применяемыми в хроматографической практике, растворителями являются ССl4, СНСl3 и CS2.

Абсорбция ИК-света может быть использована как для селективного, так и неселективного детектирования.  Если ранее детекторы этого типа применялись главным образом в эксклюзионной хроматографии с колонками большого диаметра, то в настоящее время их все шире используют в ВЭЖХ.

 Ко всем соединениям, имеющим одинаковые функциональные группы, ИКД дает примерно одинаковые показания.

В связи с независимостью показаний ИКД от молекулярной массы анализируемых соединений он имеет значительные преимущества по сравнению, например, с РМД. Молярные показания ИКД практически постоянны.

Детектор достаточно стабильно работает при повышенных температурах (~ 150 °С) ячейки. В оптимальных условиях детектор может чувствовать около 1 мкг вещества с молекулярной массой 300, содержащего функциональную группу С—Н на длине волны 3,4 мкм. Более сильно абсорбирующие ИК-излучение функциональные группы обеспечивают более высокую чувствительность, которая, однако, в среднем не превышает чувствительность РМД.

Для детектирования в микроколоночной обращенно-фазной ВЭЖХ с использованием колонок из фторопласта с внутренним диаметром 0,5 мм и длиной 10 см ИКД можно устанавливать непосредственно на конце колонки. Колонка на длине 5 мм расплющивается, и образуется проточная ИК-ячейка с длиной светового пути около 30 мкм.

В специальной литературе описано несколько систем, объединяющих жидкостный хроматограф с ИК-спектрометром, основанным на использовании преобразования Фурье. Такая система позволяет, например, производить одновременную запись нескольких хроматограмм на выбранных оператором полосах ИК-спектра. Система позволяет анализировать органические вещества на уровне массы в 1 мкг и служит для идентификации компонентов пробы, причем неполностью разделенные хроматографические пики могут быть разрешены с помощью вычислительной техники.

Как видно из приведенных выше данных, фотометрические детекторы в настоящее время прочно занимают лидирующее положение среди ВЭЖХ детекторов, и они продолжают интенсивно развиваться. Ведется поиск новых источников излучения, конструкций проточных ячеек, методов регистрации и обработки сигналов. Эти исследования, несомненно, приведут к применению фотометических детекторов в новых областях науки  и техники.


Рефрактометрический детектор

В отличие от детекторов фотометрического типа, реагирующих только на вещества, поглощающие свет в УФ-, видимой и ИК-областях спектра, рефрактометрический детектор (РМД) является универсальным детектором в ЖХ.

Принцип действия РМД основан иа дифференциальном измерении показателя преломления чистого растворителя и раствора анализируемого вещества в этом растворителе. Вклад растворенного вещества в изменение показателя преломления растворителя пропорционален объемной концентрации этого вещества, причем растворитель также является детектируемым веществом, так как имеет определенный показатель преломления.

Схема дифференциального рефрактометрического детектора представлена на рис. 2.

 

 Рисунок 2. Дифференциальный рефрактометрический детектор.

Детектор содержит измерительную 4 и сравнительную 3 проточные камеры, через которые проходит луч света, излучаемый монохроматическим источником 1 через диафрагму 2. Объем измерительной камеры детектора не превышает 10 мкл. При протекании через измерительную и сравнительную камеры детектора чистого носителя фотоэлементы 7 равномерно освещены и регистратор 8 фиксирует нулевую линию. Появление в измерительной камере анализируемого вещества вызывает изменение угла преломления луча света, и на выходе призмы 5 два луча света по-разному освещают фотоэлементы. В детекторе с непосредственным отсчетом измерение угла преломления луча осуществляется по степени засветки одного из двух фотоэлементов. В компенсационным детекторе возникший разбаланс усиливается усилителем 9 и при помощи реверсивного двигателя 6 поворачивает компенсационную призму до тех пор, пока освещенность фотоэлементов не станет одинаковой. В состоянии равновесия угол поворота призмы пропорционален разности показателей преломления анализируемого газа и газа-носителя.

Принципиальная схема детектора, в котором реализуется компенсационный метод измерения, аналогична схеме, представленной на рис. 2.

Рисунок 3. Рефрактометрический детектор, основанный на измерении отраженного луча.

Рефрактометрический детектор, основанный на измерении отраженного луча, представлен на рис. 3. Детектор представляет собой призму 5, которая служит одной из стенок проточной камеры, расположенной в плате 8. Луч света от лампы 1, пройдя через диафрагму 2, светофильтр 3 и линзу 4, падает на поверхность призмы 5, контактирующей с анализируемой жидкостью. При изменении показателя преломления вещества, протекающего через камеру, изменится интенсивность отраженного и прошедшего через линзу 6 луча, измеряемая фоторезистором 7. Объем измерительной камеры детектора 5 мкл.

В связи с указанным выше РМД обладает средней чувствительностью, а его показания в сильной степени зависят от влияющих на состав подвижной фазы колебаний параметров, таких как: давление, температура и концентрация анализируемого вещества. Поэтому РМД практически неприменим в градиентной хромато графии.

В некоторых случаях могут быть выбраны пары растворителей, имеющие близкие показатели преломления n, например, н-гептан (п = 1,3855) и н-пропанол (n = 1,3854); н-гексан (n = 1,3754) и изопропанол (n = 1,3776); н-пропиловый эфир (n = 1.3807) и метилэтилкетон (n = 1,3807). При этом становится возможным градиентное элюирование в определенных пределах концентрации смеси растворителей.

Чувствительность РМД к изменениям температуры составляет для разных растворителей 5*10-4...5* 10-6 единиц показателя преломления (е. п. п.) или единиц рефракции (е. р.) на 1 °С, а к изменениям давления (1...5) 10-6 е. р./МПа.

Чувствительность РМД к температуре требует специальных мер по стабилизации температуры самого детектора и подвижной фазы при входе в детектор. В этом случае применение длинных соединительных трубок (теплообменников) на входе в детектор приводит к высокому экстраколоночному расширению пиков и снижает достигнутую в колонке эффективность разделения.

В хроматографах с РМД для обеспечения стабилизации потока элюента и сорбируемости примесей в колонке желательно применять ее термостатирование. Для реализации минимальной чувствительности РМД на уровне 10-8 е. р. погрешность термостатирования колонки не должна превышать ±0,01 °С. 
При хорошем термостатировании РМД относительно не чувствителен к изменениям расхода подвижной фазы. Детектор достаточно прост, удобен в работе, недеструктивен и отличается высокой воспроизгодимостью показаний.

Единственным крупным недостатком РМД является его нечувствительность к веществам, имеющим одинаковый показатель преломления с растворителем.

РМД может детектировать любые вещества независимо от температуры их кипения, структуры, молекулярной массы и других физико-химических свойств. Предел обнаружения для лучших РМД достигает 10-8 е. р. Шум РМД в 100 раз выше шума УФ-детектора. Детектор хорошо применим в тех случаях, когда нет необходимости в высокой чувствительности, например в препаративной хроматографии.

РМД достаточно широко применяется в эксклюзионной хроматографии, причем применение метода регистрации дифференциала удельного показателя преломления при анализе синтетических полимеров позволило повысить параметры РМД по сравнению с параметрами его аналогов.  Погрешность метода  1...2%. Одной из основных задач в области РМД является снижение уровня шумов. Путем применения нечувствительных к вибрациям двухлучевых систем удается снизить шумы до 5*10-8 е. р., а высокоточное термостатирование совместно с улучшением оптической системы позволяет уменьшить шумы до 1*10-8 е. р.

Основными проблемами в развитии РМД являются увеличение линейности, уменьшение постоянной времени и экстраколоночное расширение пиков. Проводятся работы по использованию «холод ных» источников света в области длин волн 900...1000 нм, применение которых позволит уменьшить влияние температуры на стабильность системы детектирования.
Интересным направлением повышения чувствительности РМД является применение лазерных источников света. Описано применение Не—Ne-лазеров с энергией 0,5...4,0 Вт. Путем пропуска ния через проточную ячейку луча ионного лазера получен косвенный метод регистрации поглощения по изменению показателя преломления вещества при нагреве пробы в ячейке. Такие детекторы имеют чувствительность на два порядка выше, чем стандартные.
 
 
В основу интерферометрических детекторов положены интерференционные методы измерения показателя преломления веществ.  Для жидкостной хроматографии предложено использовать интерферометр Майкельсона с объемом измерительной камеры 161 мкл и длиной оптического пути 2 мм. Работа детектора (рис. 4) заключается в следующем.
 
 
 
Рисунок 4. Интерферометрических детектор Майкельсона.
Луч света, излучаемый источником 1, пройдя через щель 2, разделяется в полупосеребреной стеклянной пластине 3 на два когерентных луча, один из которых направляется к неподвижному зеркалу 5, а другой — к подвижному зеркалу 7. Лучи, отраженные от зеркал, вновь соединяются при помощи пластины 3 и выходят по направлению к фоторезистору 8 через диафрагму 10 и линзу 9. На пути луча, отраженного от зеркала 7, установлена проточная кювета 6, через которую прокачивается анализируемое вещество. Для компенсации луча, отраженного от неподвижного зеркала 5, установлена компенсирующая пластина 4. Изменяя положение пластины 4, можно обеспечить одинаковую разность хода лучей, тогда на входе диафрагмы 10 будут наблюдаться интерференционные полосы. При протекании через измерительную камеру детектора 6 чистой жидкости-носителя с помощью компенсирующей стеклянной пластины и подвижного зеркала 7 добиваются такой интерференционной картины, чтобы центральная ее часть, проецируемая на фоторезистор 8, была затемнена. Изменение показателя преломления жидкости-носителя приводит к смещению интерференционной картины и ее центральной части, проецируемой на фоторезистор. В результате смещения интерференционной картины на диафрагме самописца появляется последовательность пиков, причем каждый пик соответствует прохождению перед диафрагмой 10 освещенной интерференционной полосы. Установлено, что смещение дифракционной картины пропорционально числу молей анализируемого вещества в жидкости-носителе.

Флуориметрический детектор

Принцип действия флуориметрического детектора (ФМД) основан на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света. Исследования обычно проводят в УФ-области спектра при длине волны максимального поглощения для данной группы веществ, а излучение фиксируют через фильтр, не пропускающий лучи возбуждения. Длина волны флуоресцентного излучения всегда больше длины волны поглощенного света. В связи с тем, что детектирование ведется от нулевой интенсивности, ФМД более чувствительны по сравнению с детекторами поглощения.


Рис. 5. Фильтровый ФМД: 1 — источник света; 2 — блок питания; 3 — выход на регистратор; 4 — усилитель; 5 — ФЭУ; 6 — эмиссионные фильтры; 7 — кварцевые линзы; 8 — проточноая   ячейка;   9 — фильтры   возбуждения.

Обычно используется прямоугольный принцип измерения флуоресценции в ФМД. Свет от источника излучения 1 (рис. 5) пропускается через фильтры 6 и фокусируется в проточной ячейке 8 с прямоугольным расположением каналов ввода и вывода света. Эмиссионное излучение проходит через фильтры 6 и измеряется с помощью фотоприемника 5. При использовании ФМД подвижная фаза (растворитель) не должна поглощать свет ни на длине волны поглощения, ни на длине волны излучения.

Для сильнофлуоресцирующих веществ чувствительность детектора достигает 10-9 г/мл. При соответствующем выборе системы растворителей ФМД пригоден для использования в градиентной хроматографии.

С помощью ФМД с высокой чувствительностью можно детектировать аминокислоты, амины, витамины и стероиды. Высокая чувствительность является одним из главных преимуществ ФМД.

Высокая селективность и чувствительность ФМД позволяет также проводить количественный анализ микропримесей веществ и качественное определение ароматических углеводородов, биологически важных соединений, метаболитов и других флуоресцирующих соединений.

Для сильнофлуоресцирующих веществ чувствительность детектора достигает 10-9 г/мл. При соответствующем выборе системы растворителей ФМД пригоден для использования в градиентной хроматографии.
С помощью ФМД с высокой чувствительностью можно детектировать аминокислоты, амины, витамины и стероиды. Высокая чувствительность является одним из главных преимуществ ФМД.
Высокая селективность и чувствительность ФМД позволяет также проводить количественный анализ микропримесей веществ и качественное определение ароматических углеводородов, биологически важных соединений, метаболитов и других флуоресцирующих соединений.

 Техника косвенного ФМД представляет дополнительные возможности для расширения областей применения детектора. Разработаны химические методы пред- и послеколочночного получения флуоресцирующих производных большого круга органических соединений при реакциях с веществами, содержащими флуоресцирующие функциональные группы. Продемонстрирована перспективность использования послеколоночных реакций для получения флуоресцирующих производных, которые позволяют получить почти в 100 раз большие чувствительность и селективность по сравнению с соответствующими параметрами УФД, например, при определении гербицидов в образцах почвы. Результаты изучения реакций хлоранилинов с одним из флуоресцирующих аминов могут быть применены при анализе этих соединений, содержащихся в сточных водах промышленных предприятий в качестве побочных продуктов производства пестицидов и красок. Интересно использование ФМД для анализа катехоламинов и пептидов в биологических жидкостях и некоторых лекарствах, при определении флувоксамина, клавоксамина, сековерина в плазме и сыворотке крови.

Предложено применять безоконную кварцевую кристаллическую проточную ячейку для одновременного флуоресцентного, фотоакустического и фотоионизационного двухфотонного детектирования при анализе ароматических соединений. В качестве источника возбуждения использован Хе—Cl-лазер на 308 нм, сфокусированный в центре потока элюента в кварцевой ячейке. Объем ячейки 6 мкл. Рассматриваемая система сравнивалась с УФД. Ее преимуществом является возможность одновременного применения трех методов детектирования при одной конструкции. Предел детектирования на порядок ниже, чем у стандартного УФД.

Применение ФМД в ВЭЖХ дает возможность повысить селективность детектирования целого ряда соединений. Получение флуоресцирующих производных с помощью химических реакций значительно расширяет эту возможность. Флуоресцентное детектирование с одновременным изменением рН подвижной фазы после колонки позволяет увеличить флуоресценцию некоторых соединений и делает ФМД более селективным.

Селективность детектирования может быть также увеличена путем более тщательного выбора длины волны детектирования. Одновременное сканирование длин волн возбуждения и эмиссии позволяет определить чистоту пика и провести идентификацию анализируемых соединений. Применение дискретных источников возбуждения для ФМД обеспечивает более высокую интенсивность флуоресценции, большую воспроизводимость и меньший предел детектирования. Кроме Hg-лампы на 254 нм применяются Zn-лампа на 214 и 308 нм и Cd-лампа на 229 и 326 нм.

Предел детектирования для сильно флуоресцирующих веществ доведен до 5*10-10 г.

В заключение следует еще раз отметить, что ФМД в настоящее время является одним из самых чувствительных детекторов в ЖХ. Кроме того, он отличается достаточно высокой линейностью и регулируемой селективностью. Поэтому не вызывает сомнений целесообразность дальнейшего расширения работ в этой области, перспективность которых очевидна.


Электрохимические детекторы


 В ВЭЖХ наряду с широким применением оптических детекторов за последние  годы наметился значительный прогресс в развитии электрохимического метода детектирования. Доказательством этого является увеличение числа публикаций по разработке и применению электрохимического детектора (ЭХД) и главным  образом  увеличение  выпуска  аппаратуры,   пригодной  для практического использования.

Благодаря  высокой  чувствительности  и  селективности ЭХД  особенно эффективен при анализе некоторых важных для биохимии  и медицины соединений,  таких  как эстрогены и  катехоламины,  присутствующие в малых концентрациях в тканях, крови и других  сложных объектах  исследования.  ЭХД с успехом  используется также для анализа веществ при исследовании загрязнений окружающей среды ввиду его высокой чувствительности и селективности к фенолам, бензидинам, нитросоелинениям, ароматическим аминам и пестицидам.

Наибольшее применение ЭХД нашел в обращенно-фазовой и ионообменной ВЭЖХ, в которой применяют полярные элюенты, содержащие растворенные ионы и обладающие достаточно высокой электрической проводимостью. В нормально-фазовой ВЭЖХ также можно  использовать ЭХД, если  после разделительной  колонки в неполярную подвижную фазу добавлять электролит или под ходящий растворитель с высокой диэлектрической постоянной.

ЭХД основаны на определении электрохимических свойств соединений в потоке элюента, главным образом реакционной способности к окислению или восстановлению на электроде.

Рассмотрим конструктивные особенности и основные характеристики некоторых типов ЭХД.

Вольтамперометрический детектор

Наиболее распространенными в ЖХ из всех ЭХД являются вольтамперометрические детекторы (ВАД). Они применяются для анализа широкого круга неорганических и органических веществ. Работа ВАД основана на получении зависимости между силой тока, протекающего через ячейку, напряжением, приложенным к электродам, и концентрацией восстанавливающегося (или окисляющегося) на измеритель ном (рабочем) электроде вещества.

Большинство неорганических ионов могут быть электрохимически окислены или восстановлены. Среди органических соединений электроактивными являются соединения с кратными связями, окисляемыми или восстанавливаемыми функциональными группами, ароматические и другие соединения.

Поскольку для каждого класса электроактивных соединений характерен определенный потенциал окисления или восстановления, этот потенциал и определяет селективность детектора. На практике метод окисления осуществить проще, так как из элюента и из пробы не надо удалять растворенный кислород. В детекторе имеются по крайней мере два электрода: рабочий и сравнительный, по отношению к которому устанавливается потенциал рабочего электрода. В качестве сравнительного чаще всего используется каломельный или Ag/AgCl-электроды. В некоторых детекторах дополнительно устанавливается вспомогательный электрод, необходимый для подавления влияния омического падения напряжения в растворах низкой проводимости.

Вольтамперометрическими в ЖХ являются такие детекторы, в которых измеряется ток как функция времени при постоянном' потенциале на неподвижном электроде, окруженном движущейся жидкостью (элюентом). Иногда такие детекторы ошибочно называют полярографическими, хотя общепринято полярографическими детекторами считать только детекторы с капельным ртутным электродом. При превращении органического вещества А в его окисленное соединение 0 выделяется один или более электронов е- на одну реагирующую молекулу. Начальные продукты электродных реакций очень нестабильны и необратимо реагируют с образова нием стабильных соединений Р, которые больше не реагируют на поверхности электрода и удаляются потоком элюента из ячейки детектора. На электрод должен быть подан потенциал, достаточный для первичного превращения А в О. Установившийся ток прямо пропорционален  числу  n электронов, константе Фарадея F и числу молей вещества, реагирующих в единицу времени (dN/dt):

 I = n*F*dN/dt.

  При интегрировании хроматографической зоны максимальный ток зависит от числа молей N соединения, фактически вступившего в реакцию на поверхности электрода:

 Q= nFN. 

Таким   образом, эффективность ячейки  детектора определяется соотношением числа молей N, вступивших в реакцию, к общему числу молей Nобщ, выходящих из хроматографическон колонки:

Э = (N/Nобщ)/100%.

Эффективность сложным образом зависит от конструкции ячейки и расхода потока подвижной фазы.

 

Рис.6 Конструкция тонкослойной ячейки ВАД.

1,3-корпус ячейки из двух пластин; 2-прокладка; 4-рабочий электрод; 5-стягивающие пластины; 6,7-выход и вход элюента.

Теоретически показано, что может быть сконструирована ячейка, обладающая 100%-ной эффективностью, однако такая ячейка непригодна для проточного ЭХД. В большинстве случаев на практике эффективность ЭХД составляет 10% и меньше. Конструкция тонкослойной ячейки ВАД представлена на рис. 3. Блок ячейки «сэндвичевого» типа из пластмассы, обычно фторопласта-3, спрессован с прокладкой из фторопласта-4 толщиной около 50 мкм, которая образует прямоугольный канал. Рабочий электрод встав лен в стенку блока. Некоторое увеличение эффективности может быть достигнуто путем увеличения площади рабочего электрода или использования двух электродов, расположенных по обе стороны от входа потока элюента.

Материал электрода влияет на характеристики ЭХД. Органические соединения окисляются или восстанавливаются с разными скоростями на поверхности различных электродов. Желательно, чтобы электродные реакции протекали с максимально возможной скоростью, чтобы ток ячейки определялся только массопередачей молекул к поверхности, а не реакцией на поверхности. Таким образом, материал электрода необходимо выбирать с учетом его собственного окисления или восстановления и возможной электрохимической реакции компонентов, составляющих подвижную фазу (вода, органические растворители, соли, примеси). Эти электронные реакции обусловливают основную часть фонового тока. Для любых электродов и во всех подвижных фазах фоновый ток увеличивается экспоненциально в зависимости от приложенного потенциала. Поэтому при высоких отрицательных и положительных потенциалах эксплуатация детектора затруднена. Детектор работает с большой чувствительностью, селективностью и воспроизводимостью при детектировании легко окисляющихся или восстанавливаемых соединений.

В качестве материалов для электродов ячеек ЭХД применяются стеклоуглерод, углеродная паста, ртуть и амальгамированное серебро или платина. Углеродная паста (смесь спектроскопичес кого графитового порошка и диэлектрического материала, такого как минеральное масло, силиконовое масло, парафиновый смазочный материал) — наиболее широко используемый материал, имеющий свойства, необходимые для проведения органических электрохимических реакций.

Хроматография предъявляет следующие требования к материалу электродов и их поверхности: невысокие значения применяемых потенциалов; химическая и физическая совместимость с подвижной фазой; длительная стабильность.

Обычно эти три требования тесно связаны между собой. Углеродная паста имеет следующие характеристики: время жизни — обычно несколько месяцев; потенциалы — не менее +0,95 В при использовании Ag/AgCl в качестве материала для сравнительного электрода; подвижная фаза может содержать органический растворитель высокой концентрации.

В ряде случаев требуется достаточно частое обновление поверхности электродов. В классической вольтамперометрии (включая полярографию) считается, что такие молекулы пробы, как липиды или белки, «отравляют» поверхность электродов после нескольких вводов пробы. Присутствие высокомолекулярных соединений в потоке приводит к серьезным проблемам, так как такие вольтамперометрические измерения проводятся для проб с концентрациями более 10-5...10-3 моль/л. В этом случае электродная реакция может привести к образованию полимера, который «пассивирует» поверхность и приводит к невоспроизводимым результатам анализа. В случае хроматографического амперометрического детектирования колонка очищает ПФ, поток ПФ непрерывно очищает поверхность электрода, концентрации пробы находятся в диапазоне 10-8... 10-6 моль/л. Кроме того, электрод подвержен единичному воздействию некоторого вещества в течение короткого временя, соответствующего ширине зоны этого вещества в ЖХ. Все указанные факторы облегчают работу электрода при хроматографическом амперометрическом детектировании по сравнению с прямыми (нехроматографическими) электрохимическими измерениями.

Потенциометрический детектор

Метод потенциометрического детектирования (ПЦД) концентрации ионов в потоке основан на измерении разности электрических потенциалов двух электрдов, один из которых в процессе измерения имеет постоянный потенциал. Так как абсолютную величину электродного потенциала измерить невозможно, измеряют потенциал измерительного (индикаторного) электрода относительно потенциала сравнитель ного электрода, который должен быть постоянным.

В потенциометрическом детекторе (ПЦД) в качестве сравни тельного обычно используется хлорсеребряный электрод. Наиболее часто потенциометрический метод измерения применяют в рН-метрии. Для точных измерений с ионселективными электродами подвижная фаза должна иметь относительно высокую и постоянную ионную силу. Следовательно, ПЦД имеет ограниченное применение для неорганических систем без градиентного элюирования. Основное преимущество ПЦД заключается в следующем: при потенциометрических измерениях не надо удалять из элюента и анализируемой пробы растворенный кислород, как, например, при полярографических измерениях.

Разработан дифференциальный ПЦД, состоящий из двух камер, разделенных ионообменной мембраной. Элюент с анализируемым веществом проходит через одну камеру, а чистый элюент — через другую. Записываются потенциалы мембраны с использованием двух сравнительных электродов. Предел детектирования 1 нмоль.

 Полярографический детектор

В 1958 г. для ВЭЖХ был предложен полярографический детектор (ПГД) с ртутным капельным электродом. Однако его использование до настоящего времени ограничено. При работе с ПГД измеряется сила электрического тока между поляризуемым и неполяризуемым электродом при заданной постоянной разности потенциалов. В режиме восстанов ления из элюента и из пробы необходимо удалить растворенный кислород и примеси металлов. В последующие годы появились улучшенные конструкции ПГД. ПГД находят применение для определения нитроанилинов нитрофенолов, хлорнитробензолов, нитроалканов, нитронафталинов, n-метоксиазобензолов, N-нитрозоаминов, стероидов.

Кулонометрический детектор

Эти детекторы названы так в связи с тем, что анализируемые вещества в них электризуются полностью в отличие от амперметрических, в которых эффектив ность электролиза не превышает 10%. Кулонометрические детек торы (КМД) имеют рабочие электроды с большой поверхностью.

КМД используется для селективного определения витаминов, наркотиков и лекарственных препаратов. Для детектирования соединений с высокими окислительно-восстановительными потен циалами применен принцип двух последовательно расположенных Рабочих электродов, один из которых (вышестоящий по ходу потока является кулонометрической ячейкой для полного окисления примесных веществ с более низкими потенциалами, чем анализи руемые соединения. Детектирование последних осуществляется вольтамперометрической ячейкой. Система ВАД— КМД позволяет провести селективное детектирование неразделенных пиков.

 Преимуществами ЭХД любых типов являются простота конструкций и низкая стоимость, с одной стороны, и высокая чувствительность и селективность — с другой. Причем имеется возможность регулирования селективности путем смены режимов работы детекторов, замены или модифицирования электродов.

Для ЭХД можно реализовать малый рабочий объем (до 1 нг и меньше) по сравнению с другими ВЭЖХ детекторами. ЭХД малым рабочим объемом может быть применен в микроколоночной и капиллярной хроматографии, что особенно актуально в связи с их быстрым развитием. Преимуществом ЭХД является также малая зависимость их показаний от температуры.

К недостаткам ЭХД следует отнести уменьшение их чувствительности со временем в связи с изменением характеристик электродов, применение ртути в некоторых типах ЭХД, зависимость сигнала от расхода элюента и ограниченное применение в ВЭЖХ при градиентном элюировании.

Детектор радиоактивности

Разделение и количественное определение радиоактивных веществ находит достаточно широкое применение при анализе меченых соединений в целях дозиметрического контроля при изучении химических реакций в органической и неорганической химии, биологии, микробиологии и медицине при биомедицинских исследованиях.

Известны два принципиально различных типа детекторов радиоактивности (РАД) для ЖХ.

РАД первого типа основан на методе предварительного смешивания раствора сцинтиллятора с элюентом перед входом в детектор с последующим пропусканием смеси через сцинтилляционный счетчик. Такой метод обычно называют методом жидких сцинтилляторов.

Второй тип РАД основан на использовании проточных ячеек сцинтилляционных счетчиков, заполненных частицами твердых сцинтилляторов. Например, для обнаружения ß-излучения в потоке элюента применялись твердые сцинтилляторы в виде стеклянных шариков, содержащих 2,5...7,7% лития, с общей массой около 0,5 г. Обычно проточные ячейки для РАД изготавливают из стекла или фторопласта.

Наибольшую трудность при применении РАД представляет собой обеспечение необходимой скорости счета, которая прямо пропорциональна рабочему объему детектора и обратно пропорциональна расходу потока элюента. РАД измеряет активность потока элюента в проточной ячейке и преобразует ее в напряжение выходного сигнала. При этом необходимо также учитывать фоновый сигнал, причем скорость фонового счета обычно составляет около 30 счетных единиц в минуту. При увеличении рабочего объема V детектора и уменьшении расхода потока W элюента чувствительность РАД при прочих равных условиях увеличивается. Однако эти изменения приводят к ухудшению достигнутого на колонке разрешения. С уменьшением V при постоянном W и при сохранении эффективности разделения падает чувствительность детектора. Пропорциональное изменение V и W в сторону их уменьшения или увеличения не изменяет чувствительности детектора, что означает одинаковую чувствительность и универсальность применения его как в аналитической, так и в препаративной хроматографии.  Рекомендуется, чтобы объемячейки РАД был не более 0,1 объема элюента, в котором выходит первый пик хроматограммы анализируемой смеси. При применении твердых сцинтилляторов получены следующие значения эффективности счета: 6% для 3Н; 10% для 32I; 70% для 15С и 7% для 123I. В этом случае эффективность счета зависит также и от размера частиц сцинтиллятора. Уровень шума соответствует наличию ЭН в пробе в количестве (2...6) 10-14 моль.

Преимуществами РАД являются хорошая воспроизводимость показаний, большой диапазон линейности детектирования, нечув ствительность к изменениям потока элюента и в связи с этим применимость при градиентном элюировании, низкий предел детек тирования (около 100 счетных единиц в минуту для 14 c), применимость в препаративной хроматографии и для большого круга b а- и у-радтоактивных элементов.

Детектор по светорассеиванию

Детектор по измерению светового рассеяния (СРД), основан на различии в давлении паров обычно используемых в ЖХ растворителей и анализируемых веществ. Принципиальная схема детектора приведена на рис. 7.

Рис. 7.  Детектор   светового  рассеяния: 1 — вход элюента; 2 — подводящая трубка; 3 - уплотнение; 4 — сопло; 5 — камера распыления; 6 — нагреватель; 7 — корпус детектора; 8 — камера испарения; 9 — трубка для выхода луча; 10 — камера светорассеяния; 11 — трубка для выхода по. тока; 12 — стеклянное окно; 13 — двойная дкафраг. иа;  14 — стеклянный стержень.

Элюент на выходе из колонки 1 распыляется в камере 5 при повышенной температуре. В камере испарения 8 растворитель испаряется, а поток частиц нелетучих анализируемых веществ рассеивает свет лазерного луча в камере светорассеяния, в которой имеется стеклянный стержень 14, расположенный перпендикулярно лучу лазера на расстоянии 2...5 мм от него. Стержень служит в качестве коллектора рассеянного света. Через стержень часть рассеянного света попадает на фотоумножитель. Показания СРД пропорциональны массовой скорости потока вещества, что особенно важно при его использовании с колонками малого диаметра. Фоновый ток СРД при включенном лазере и установленном потоке предварительно нагретого несущего газа (CO2 или N2) около 2*10-10 А; шум 1*10-11А. Вклад СРД в расширение полосы пробы 0,1...0,2 мкл. Нулевая линия стабильна даже привысоком градиенте концентраций, однако показания пропорциональны массовому потоку анализируемого вещества в степени 1,8. Предел детектирования при анализе метиловых эфиров жирных кислот и триглициридов в различных пробах около 150 нг/с. Основным требованием является условие, чтобы анализируемые вещества были жидкими или твердыми при температуре детектора.