Добро пожаловать


• Вход  • Регистрация
• Забыли пароль?

Обратная связь

О фирмах

Разделы

Сорбенты

Хроматографические колонки для жидкостных хроматографов

В настоящее время колоночная ЖХ является одним из самых быстроразвивающихся инструментальных методов. Это обусловлено прежде всего тем, что практически любое вещество биологической или неорганической природы может быть растворено в какой-либо жидкости без необратимой потери своих качеств, и, следовательно, все данные вещества могут быть проанализированы и очищены методами ЖХ. Причем относительная простота данного метода позволяет достаточно легко масштабировать любые процессы, т.е. подобрав условия хроматографического разделения на аналитической системе достаточно легко провести аналогичное разделение большего количества того же вещества, пропорционально увеличив объем колонки.  Но для успешного масштабирования необходимо соблюдение нескольких обязательных условий. В частности, для сохранения прежнего хроматографического профиля, кроме всего прочего, качество исполнения колонок должно быть аналогичным. Это достижимо только при стандартизации размеров и их прецизионного исполнения. 

Устройство колонок

В связи с вышеперечисленными методами колонки для жидкостной хроматографии (КЖХ) выполняются из высокопрочных устойчивых к действию агресивных сред металлов (легированной стали, титана и т.д.) или из кварцевого стекла с полированными внутренними стенками. Реже выпускают колонки изготовленные из химически стойких пластиков. Как уже отмечалось, существует множество типов колонок: для хроматографии низкого и высокого давления;  для аналитической, препаративной или промышленной хроматографии; для радиальной или аксиальной хроматографии. Также колонки подразделяют на неразборные  (упакованные в заводских условиях) и  разборные с подвижными и не подвижными адапторами. Каждый тип колонки имеет свои конструкционные особенности. Ниже будут описаны основные составные части  КЖХ и, по возможности,  конструкционные отличия основных типов.
Конструкционно КЖХ состоит из обязательных частей: трубки и адапторов, и не обязательных частей: рубашки термостата, гидравлической системы для упаковки колонки и т.д.

Неразборные колонки

Данный тип колонок в основном используется в аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии, так как данный метод в основном используется для качественного и количественного анализа, при котором особенно важна воспроизводимость результатов. Наилучшим способом достижения данного результата является использование масштабного фабричного поризводства унитарных колонок со строго соблюдаемыми параметрами всех комплектующих. На рынке представлено огромное количество колонок данного типа  различных производителей очень высокого качества, различающимися, главным образом, используемыми в них сорбентами. Не смотря на то, что многие фирмы предлагают примерно одинаковый спектр КЖХ как по физическим размерам колонок, так и по заявленному составу неподвижной фазы, тем не менее именно новшества, привносимые каждой фирмой в производство своих сорбентов иногда приводят к очень значительным различиям по селективности, долговечности и воспроизводимости на конкретных смесях.
Поэтому при подборе ЖКХ для анализа конкретной смеси необходимо:
1) определиться с типом будущего хроматографического анализа (нормальнофазная или обращеннофазная. или ионообменная и т.д.);
2) провести сравнительные тесты колонок различных производителей с выбранным типом сорбента.
Конструктивно данные колонки представляют собой трубки из не подверженных коррозии сплавов (Рис. 1) или пластика в которые запрессован сорбент. С двух сторон колонки имеют резьбовые отверстия с коническим углублением для фитингов. Внутренний диаметр от 1  до 10 мм, длина 10-400 мм.

Рис. 1. Аналитические колонки для ВЭЖХ.


К данному типу КЖХ также можно отнести колонки (картриджи) для проведения двердофазной экстракции и схожие с ними по принципу  картриджи для выделения нуклеиновых килот. Принципиальным отличием данных колонок от применяемых в аналитических хроматогрофах является черезвычайно малое количество (от десятков до сотен миллиграмм) адсорбционного материала, размещенного в ячейке с большим соотношением диаметр/длина. Смыв аналитов с адсорбента осуществляется сравнительно небольшим объемом растворителя (в пределах десяти миллилитров), что дает возможность сильно сконцентрировать аналит, но не позволяет провести полноценную хроматографию.

Разборные колонки

Как ясно из названия колонки данного типа разбираются на составные части: на трубку и адапторы. Это свойство позволяет самостоятельно заполнять колонки  необходимым сорбентом. Практически все колонки для хроматографии низкого давления производятся именно в таком исполнении, как аналитические, так и препаративные. В ВЭЖХ данный вид колонок применяется в высокопроизводительных хроматографах (препаративных и промышленных). Адапторы бывают подвижные и не подвижные, и колонки, в зависимости от исполнения бывают с двумя неподвижными адапторами, с одним подвижным и одним неподвижным адапторам (самая распространенная комплектация) и с двумя подвижными адапторами.

Адапторы

Для удержания сорбента, поддержания постоянного внутреннего объема и создания равномерного и ламинарного потока ПФ через все поперечное сечение колонки используются адапторы.

Подвижные адапторы используются для регулирования внутреннего объема колонки. Принципиальная конструкция подвижного адаптора для аксиальных колонок представлена на риунке 2.


Рис. 2. Конструкция   адаптера. 1 — корпус; 2 — фильтр (мембрана); 3 — прижим; 4 — уплотнительное кольцо; 5 уплотнение трубки; 6 — гайка при­жима;   7— трубка для поступления (выхода) ПФ.

Материалы колонки

Материалы из которых выполнены составные части адаптора различаться могут сильно различаться в зависимости от цели и условий хроматографии. Так при ВЭЖХ практически все части как адапторов (даже мембрана), так и колонки выполняются из металла. При хроматографии низкого давления колонка зачастую выполняется из стекла, а детали адаптора из химически стойкой пластмассы (полиэтилена, тефлона и т.д.).

Набивка колонки

Набивка колонки - очень ответственный процесс, от качества выполнения которого практически полностью зависит успех дальнейшего эксперимента. Основной опасностью при набивке являются неоднородности, которые могут образоваться по разным причинам и привести к размыванию пиков и, в конечном итоге, к неудовлетварительному результату хроматографии. Неоднородности могут образовываться от:

1) неравномерного заполнения колонки в результате слишком быстрого осаждения сорбента или неравномерности осаждающего потока;

2) посторонних включений в сорбент (пузырьки воздуха, грязь, колонии микроорганизмов и т.д.);

3) неоднородности размеров гранул сорбента.

Для недопущения неравномерного заполнения колонки необходимо заполнять колонку однородной, свежеприготовленной  суспензией постепенно добавляя новые порции суспензии до заполнения сорбентом требуемого объема колонки, после этого следует установить верхний адаптор не допуская образования пузырьков воздуха и пустить поток подвижной фазы для окончательного осаждения сорбента. Следует отметить, что для достижения нужного результата обязательным условием является чистота мембран и одинаковая проницаемость по всей площади.

Посторонние включения такие как грязь и колонии микроорганизмов образуются в результате неправильных условий хранения или неправильной регенерации сорбента и предупреждаются только полным соблюдением регламента или заменой сорбента. Пузырьки воздуха могут образовываться в двух случаях: при слишком интенсивном суспензировании или при неаккуратном вливании суспензии в колонку. В обоих случаях происходит расплескивание суспензии и таким образом происходит захват трудноотделимых пузырьков. Зачастую, в данном случае необходимо перенабивать колонку.

Неоднородноти размеров гранул встречаются при использовании сорбентов старых марок, экспериментальных сорбентов или использованных ранее сорбентов, в которых присутствует мелкодисперсная фракция разрушенных гранул. При всех приведенных случаях необходимо производить отмучивание (декантацию) суспензии.  Для этого разбавленную суспензию набухшего, промытого и переведенного в нужный буфер (см. ниже) сорбента заливают до­верху в мерный цилиндр, объем которого в 5—6 раз больше, чем объем упакованного влажного сорбента, и дают ему осесть до того момента, когда между слоем сорбента и мутной жидкостью над ним обозначится резкая граница. Гранулы смолы или сефадексов оседают относительно быстро — за несколько минут (в зависимости от их среднего размера), а целлюлоза — медленнее (за 10—30 мин). Жид­кость над осадком вместе со взвешенными в ней мелкими частицами отсасывают и отбрасывают. Снова дополняют цилиндр буфером, осторожно палочкой взмучивают осадок по всему объему цилиндра и повторяют описанную операцию до тех пор (3—5 раз), пока жид­кость над только что образовавшимся осадком не будет совершенно прозрачной. Затем выжидают еще некоторое время (до полного осе­дания слоя сорбента), измеряют его высоту линейкой и отсасывают буфер — на этот раз не полностью, а до такого уровня, чтобы слой жидкости составлял половину высоты осадка. Такое соотношение при взмучивании позволяет получить кашицу («slurry»), консистен­ция которой наиболее удобна для заливки в колонку.

В преперативной хроматографии (особенно ВЭЖХ) для забивки колонки используют гидравлические системы, позволяющие равномерно уплотнять сорбент и удерживать его в заданном объеме во время хроматографии. В этом случае, для достижения оптимального результата необходимо строго придерживаться руководства производителя по используемому при упаковке давлению на сорбент. В случае отклонений от заданных условий упаковки может произойти или пережатие сорбента (при превышении давления), или образовываться полотсти (при меньшем давлении).

Классификация колонок для ВЭЖХ (по данным ф. Аквилон)

В зависимости от площади поперечного сечения и длины колонки можно разделить на макромасштабные препаративные, препаративные, полупрепаративные, стандартные аналитические колонки, микроколонки и капиллярные колонки.

 

Колонки для радиальной хроматографии

Рис.3. Колонка для радиальной хроматографии фирмы Sepragen

Колонки для радиальной хроматографии конструкционно отличаются от описанных выше коаксиальных колонок. В данном типе колонок слой сорбента представляет собой "трубку" и поток ПФ направлен с наружной поверхности данной "трубки" и элюируется внутри "трубки".  Такая конструкция значительно  сложнее  применяемой  в коаксиальной  колонке,  но  за счет значительно увеличенной площади внешней мембраны можно значительно увеличить скорость нанесения, а за счет значительно меньшей площади выходной мембраны при элюции адсорбат концентрируется, что требуется при многих биотехнологических процессах. Еще одним достоинством данной конструкции является легкость масштабируемости. Для моделирования данного процесса можно использовать сектор пропорциональный колонке