К чему ведет выбор сорбента с неподходящей пористостью при обращенно-фазовой хроматографии белков

Исходные данные эксперимента
Использованное оборудование: 
Прибор: жидкостной хроматограф фирмы Dionex UltiMate 3000 в составе: автосемплер - WPS-3000; насос – LPG-3400A; термостат - TCC-3000; UV-детектор - VWD-3100; Колонка Acclaim 120 C18 150×2,1 mm.

Обращенно-фазовая хроматография, наверное, самый распространенный метод колличественного и качественного определения белков в сложных системах, а также самый оптимальный, по соотношению выход/степень очистки, метод препаративного и промышленного получения высокоочищенных (более 90%) белков. Но для достижения эффективности и воспроизводимости получаемых данных необходимо провести ряд обязательных дополнительных исследований. Одним из которых является правильный подбор неподвижной фазы. В настоящее время большинство приложений в ОФ ВЭЖХ белков основано на использовании сорбенто на основе пористого оксида кремния (силикагеля) с ковалентно присоединенными к их поверхности органическими радикалами, за счет чего создается достоточно стабильный гидрофобный слой, способный взаимодействовать с различными неполярными молекулами. В подавляющем большинстве случаев в качестве органических радикалов используются остатки предельных углеводородов с различным чилом атомов углерода, по числу которых фазы и различают: С4 соответствует привитой бутильной группе, С8 - октильной, С18 - октадецильной и т.д. Как известно из теории, чем выше площадь раздела фаз, тем выше эффективность массопереноса аналита, а, следовательно, и разделения. В стремлении повысить эффективность производители стали уменьшать размеры матрицы сорбента и его пор в результате чего достигли большого успеха, так сорбент с размером зерна 3 мкм и пористостью в 60А имеет площадь поверхности более 600 м2/г. Понятно, что эффективность разделения будет очень хорошая, НО ТОЛЬКО:

1. для низкомолекулярных соединений;

2. при использовании содержащих растворители фаз.

Объяснение второго условия достаточно подробно описано в очень хорошей книге Олега Борисовича Рудакова "Спутник хроматографиста", мы же поговорим про первое. Низкомолекулярные соединения практически не отличаются по своим размерам от молекул подвижной фазы в следствии чего проникают всюду, куда проникает сама подвижная фаза, в результате чего массоперенос данных молекул практически одинаково эффективен как с поверхности гранул, так и внутри пор гранул. Но при хроматографии высокомолекулярных соединений, размеры которых значительно превосходят размеры молекул растворителя данное условие не соблюдается, т.к. для молекул аналита доступна только часть поверхности из-за стерических ограничений размерамип пор. Таким образом, если поры слишком узкие, то для большой молекулы их поверхность не доступна и разделение происходит на очень ограниченной поверхности гранул из-за чего эффективность разделения падает в разы и происходи много других всяких гадостей, об одной из которых ниже. Но в тоже время, слишком большая поверхность пор сорбента также не оптимальна, т.к., во-первых, снижается площадь поверхности, а, следовательно, и эффективность, а, во-вторых, перестает проявляться очень полезное при обратно-фазной хроматографии белков свойство "все или не чего". В качестве иллюстрации данного свойства приведен рисунок 1.

Рисунок 1. Зависисмость времени выхода аналита от содержания растворителя в подвижной фазе. (Рисунок взят из каталога фирмы YMC)

Как мы видим на рисунке при хроматографическом определении низкомолекулярного (MW=194) аналита (показано красным цветом) его элюция может происходить в достаточно широких пределах концентрации растворителя и сдерживающим фактором является только время хроматографии. А вот при хроматографии белка с молекулярной массой почти на 2 порядка выше зависимость принципиально другая: белок начинает элюироваться только по достижении некого порогового значения содержания растворителя, а при его превышении буквально на несколько процентов он перестает удерживаться на колонке полностью. Из данного рисунка легко сделать несколько очень важных выводов, один из которых объясняет, почему при обращенно-фазной хроматографии белков практически ни когда не используется изократическая элюция: он не "ползет" по колонке, а элюируется или "сидит" на ней вне очень узкого предела характерного именно для данного белка, мимо которого очень легко "проскочить" из-за чего угодно, а второй вывод, который очень облегчает ОФ ВЭЖХ белков,  - это возможность очень эффективного использования многоступенчатого градиента для полседовательного удаления мешающих примесей без боязни, что на их фоне начнет элюироваться целевой белок. Скорее всего, данный механизм элюции обусловлен тем, что при разделении белков, кроме законов распределительной хроматографии очень большую роль играют и стерические взаимодействия белка с порами. Таким образом, слишком высокая пористость также будет отрицательно сказываться на результате разделения (правда, значительно в меньших масштабах, чем при мелких порах). Следовательно при хроматографии высокомолекулярных белков необходимо обязательно подбирать сорбент с подходящей пористостью.

В связи с этим фактом фирмами-производителями обращенно-фазных сорбентов для разделения белковых препаратов разработана достаточно условная, но позволяющая проводить предварительный отсев сорбентов, зависимость оптимума пористости от размера (массы) белка (рисунок 2).

Рисунок 2. Зависисмость оптимума пористости гранул обращенно-фазового сорбента от размера (массы) белка. (Рисунок взят из каталога фирмы YMC)

Ну и напоследок, в качестве иллюстрации к вышесказанному, приведу пример, что происходит, если белок и размер пор не подобраны правильно. Как Вы видете в моем профиле оборудования я использую колонку C18 с размером пор 120А (другой, к сожалению, нет иначе бы не писал:). Так вот как видно из рисунка 2 верхний предел ее использования ограничен 20 кДа (назовем его Prot), как раз примерно такого размера белки я и анализировал в 2 предыдущих записях блога. Все было более-менее нормально. Но вот стало необходимо проанализировать альбумин человеческий в смеси с Prot. Размер HSA около 67 кДа и ему бы надо, в соответствии с рисунком 2, как минимум 300А. Но, повторяюсь, колонка только одна и я "попробовал". Провел первый прикидычный градиент: пик вышел, но сильно "хвостит". Ладно, ни чего страшного, колю по это му же градиенту Prot и вижу, что на месте HSA вдруг появилась какая-то примесь, не встречавшаяся ранее в Prot. Никогда. Повторяю уже со стандартом Prot и наблюдаю ту же картину, только пик примеси стал меньше. (рисунок 3)

В результате я делаю простой вывод: данная примесь - HSA, оставшийся на колонке. Вероятно, какая-то часть HSA все же затиснулась в поры сорбента, а вылезти может уже с трудом (как Винни Пух из кролечьей норы) , отсюда и "хвостатость" пика и постепенное снижение его количества во вдруг появившихся пиках. После еще 3 холостых прогонах градиента этот пик пропал окончательно, а альбумин на эту колонку я колоть зарекся.

Рисунок 3. Сравнение хроматограмм албумина (синим), Prot (красным) и стандарта Prot (черным).

Поздравляю всех с праздниками, а, особенно, с длинными выходными.

 

О пользователе

Василий's picture
User offline. Last seen 25 weeks 1 day ago. Offline
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Joined: 20/05/2009