Влияние температуры на разрешение пиков при ОФ ВЭЖХ хроматографии белковых смесей

Хорошо известно, что увеличение температуры значительно ускоряет массоперенос при хроматограмии. Особенно часто данный прием оптимизациии хроматографического разделения используют в распределительной хроматографии, где массоперенос аналита между хроматографическими фазами зачастую подобен (даже теории такие есть) массопереносу между двумя несмешивающимися (полярной и неполярной) жидкостями, а, следовательно, зависит от температуры наиболее сильно. Судя по литературным источникам в обращенно-фазной хроматографии низкомолекулярных соединений увеличение температуры приводит к значительному увеличению времен удерживания и, следовательно, разрешению отдельных пиков. Про обращенно-фазовую хроматографию белков написано значительно меньше и уж практически совсем ни чего не написано про такие вот «мелочи». Мой же интерес к этому заключается в том же: получении наилучшего разрешения при хроматографировании загрязненного белка на имеющейся в моем распоряжении колонке при использовании водно-ацетонитрильной подвижной фазы, модифицированной трифторуксусной кислотой (ТФУ). В прошлый раз я приводил результаты серии экспериментов по поиску зависимости разрешения пиков в зависимости от концентрации ТФУ. В результате получилось, что оптимальное разрешение было при использовании 0,3% ТФУ (дальше я не пошел), но такая концентрация килоты может, при длительном использовании, просто растворить матрицу, так что пришлось остановиться на проверенных 0,2% и искать другие способы улучшения разрешения пиков.

 Одним из таких способов является изменение температуры. Мною были проведена серия опытов в результате чего было показано что, при увеличении температуры от 10 до 35 ˚С время удерживания пика (рисунок 1), как и разрешение пиков примесей значительно выросло (рисунок 2).

 

Рисунок 1. Сравнение хроматограмм разделения белковых смесей, полученных при разных температурах: коричневый -10˚С, синий - 15˚С, черный - 25˚С, розовый - 35˚С.

Таким образом, на рисунке 1 показано, что в данном диапазоне температур измнеие температуры на 10 ˚С приводит к изменению удерживания данного белка в данной хроматографической системе на 1-1,5 мин. 

Рисунок 2. Сравнение хроматограмм разделения белковых смесей в режиме нормализации по главному пику, полученных при разных температурах: коричневый -10˚С, синий - 15˚С, черный - 25˚С, розовый - 35˚С.

На риунке 2 хорошо видно, что с увеличением температуры во время проведения хроматографии пики примесей «разбегаются» от основного пика, что однозначно говорит об улучшении разделения  и соответствии результатов теории.

Данное сранение достаточно неоднозначно, т.к. время выхода пиков тоже отличается почти в 2 раза, поэтому позднее я провел дополнительное сравнение разрешения пиков при 10 и 35 мин. Для этого был подобран специальный градиент, с той же скоростью увеличения элюирующей силы (тем-же наклоном), что и при основном эксперименте, но с меньшим процентом растворителя в начале, что позволило "совместить" пик основного вещества при проведении хроиатографии при 10˚С со временем выхода этого вещества при использовании стандартного градиента при 35˚С. На рисунке 2а хорошо видно, что селективность пиков осталась практически прежней, но разрешение пиков значительно выросло, скорее всего за счет более высокой эффективности.

Рисунок 2а. Сравнение хроматограмм разделения белковых смесей, полученных при разных температурах: черный-10˚С, синий - 35˚С.

Но при последующем увеличении температуры до 45 и 55 ˚С картина была не стольоднозначна. Так на рисунке 3 показано сравнение всех полученных хроматограмм.

Рисунок 3. Сравнение хроматограмм разделения белковых, полученных при разных температурах: коричневый -10˚С, синий - 15˚С, черный - 25˚С, розовый - 35˚С, салатовый - 45˚С и голубой - 55˚С.

Хорошо видно, что пик основного белка при 45 ˚С лишь незначительно (на 0,2 мин) изменил время элюции, а при 55 ˚С  пик «пошел на попятную».  Более наглядно это продемонстрировано на рисунке 4.

Рисунок 4. Сравнение хроматограмм разделения белковых, полученных при разных температурах: розовый - 35˚С, черный - 45˚С, синий - 55˚С.

Нарисунке 4 также хорошо видно, что при увеличении температуры выше 35 ˚С основной пик стал принимать форму больше похожую на колокол, чем на Гауссовую кривую и при 55 ˚С стало явно видно, что причина этого в появлении еще одной пары (с права и слева) примесей. Я не случайно употребил в предыдущем предложении глагол «появление», а не «разделение». Моя нерешительность в употреблении основана на нескольких предпосылках/размышлениях:

1. Белок при аповышении температуры сверх физиологического уровня мог начать денатурировать и тогда мы наблюдаем появление именно его денатурированных производных, на это (изменение его гидрофобности) косвенно показывает его аномальное поведение – уменьшение времени удерживания;

2. Пористость колонки 120А – не оптимальна для белков такого размера (20 кДа), что должно вызывать стерические затруднения (эксклюзию) при проникновении белка в поры сорбента и до достижения «физиологического» порога температуры взаимодействие молекул белка с порами матрикса происходило по одному механизму, а после его преодоления – по другому, причем скачкообразно, что мы и видим по аномальному изменению времени выхода.

3. Я не знаю «истинную», проверенную на «правильной», фармакопейной колонке с пористостью 300А чистоту данного препарата, но новая «правая» примесь со временем выхода 11,7 мин может соответствовать действительности, а вот появляющееся «левое» плечо я ни когда ранее в таком большом количестве не наблюдал.

4. При анализе разрешения «нормальных» примесей – маркеров, поведение, которых было предсказуемо в диапазоне температур 10-25 ˚С  и хорошо проиллюстрировано на рисунке 2, оказалось, что и их разрешение при переходе от 35 к 55˚С не только не увеличилось, но и снизилось (рисуно 5). Раз у одних примесей разрешение снижается, то почему же тогда у вновь появившихся «примесей» разрешение увеличивается?

 

Рисунок 5. Сравнение хроматограмм разделения белковых смесей в режиме нормализации по главному пику, полученных при разных температурах: розовый - 35˚С, черный - 45˚С, синий - 55˚С.

Вообщем на тот момент вопросов было больше чем ответов, а однозначный вывод пока только один: влияние температуры на разделение белковых растворов методом  обращено фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии не линейно и очень сильно зависит структуры белка и его примесей, за счет чего имеется некий экстремум. Но выход, пусть и косвенный, но нашелся: у меня имеется высокоочищенный, соответствующий фармакопее, препарат данного белка (не стандарт). И я решил сравнить его поведение во время хроматографии при высоких температурах с исследуемым, грязным образцом. Для более достоверного сравнения оба образца были вколоты в таких количествах (объемах), чтобы высоты их пиков были примерно одинаковы. Результаты хроматографий, проведенных при 55˚С приведены на рисунке 6.

Рисунок 6. Сравнение хроматограмм очищенного (черный) и загрязненного (синий) образцов, полученных при 55˚С.

Хорошо видно, что пик очищенного материала сохраняет форму Гауссовой кривой в отличии от исследуемого, загрязненного образца. Следовательно, мы доказали, что «появившиеся» пики не являются фантомными, а сигнализируют о наличии близкородственных примесей у которых повысилось разрешение относительно главного вещества, хотя это и противоречит поведению других примесей, уменьшивших свое разрешение.

Тем самым можно сделать вывод, что высокомолекулярные белковые молекулы имеют разный отклик на изменение температуры при проведении ОФ ВЭЖХ, что требует дополнительных исследований по поиску оптимума.

Также хотелось бы отметить значительный рост разрешения пиков при увеличении температуры от 10 до 25˚С. Это говорит о том, что проводя препаративную ОФ ВЭЖХ хроматографию похожей смеси белков в той же хроматографической системе не при +4-10˚С, как это зачастую  принято на производстве, а при комнатной, можно достичь значительно более высокого выхода готовой продукции. К тому же хроматографию можно провести за более короткое время, т.к. мониторинг давления (рисунок 7) показал, что при переходе от 10 до 25˚С давление в системе упало почти в 1,5 раза (co 180 до 120 бар).

 

Рисунок 7. Сравнение профилей давления в системе, полученных при разных температурах проведения хроматографического разделения: голубой -10˚С, салатовый - 15˚С, коричневый - 25˚С, розовый - 35˚С, черный - 45˚С и синий - 55˚С.

Желаю всем удачи и хорошего настроения.

 

Artem's picture

 Судя по этому

 Судя по этому (http://www.sepscience.com/Techniques/LC/Articles/374-/HPLC-Solutions-53-...), время удержания, я так пологаю, низкомолекулярных соединений уменьшается с повышением Т. Да я и сам как-то поигрался со стандартами, и время удержания было уменьшено. Разрешение между пиками растет, видимо, за счет увеличения эффективности, благодаря сужению пика из-за улучшения массопереноса.  

А не подскажите, в ион-парном режиме обращенно-фазовой хроматографии белков, можно ли почистить белки с распределением молекулярных весов: 10кД, 40кД и 80кД, достаточно гидрофобных, имея в наличии только фазы С18 и С8? Как ион-парный агент используем ТФУ.
А есть ли еще какие-нибудь варианты очистки этих белков с имеющимися колонками? 
Спасибо!

Василий's picture

Здравствуйте

Ну какие еще могут быть варианты на колонках для ОФ хроматографии? Только ОФ и ее варианты, например, та же самая ион-парная. Можно попробовать добавлять в ПФ соли или иные компоненты. Но, как всегда надо пробовать. Различия масс большие, так-что в ОФ режиме велика вероятность, что разделение пройдет хорошо, но нельзя исключать, что, не смотря на разницу в массах, они будут иметь одинаковую гидрофобность и тут придется подбирать условия или использовать другой метод разделения. Вообще, разницы масс значительные - в разы и, поэтому, я бы предложил гель-фильтрацию на низкопористых сорбентах, типа Diol-100 или Diol-200. В принципе, меня всегда интересовало: получиться ли эффект гель-фильтрации при использовании пористого ОФ-сорбента в присутствии низкополярной (обеспечивающей проскок всего материала) ПФ? Если у вас колонка хотя бы 250*4,6 и пористость в районе 120A, то попробуйте на всякий случай: вдруг все разделение получиться проводить в 1 СV?

Artem's picture

Â К сожалению,

 К сожалению, из обращеннофазовых имею в наличии только С18 и С8 с пористостью 300А, через них белок пролетает одним пиком при низкополярной ПФ. На С8 в плавном градиенте изопропанолом с ТФУ начинает что-то делиться, но пики слишком широкие, а я бы хотел собрать белок. Пробовал делить на GF-250 (из всего что есть), по-моему, там поры 250А, так, конечно, ничего не получилось, один широкий пик. И да, белки очень гидрофобные (растворены в 6М мочевине), тут бы, наверное, колонку С3.
 

Artem's picture

 Просто я

 Просто я читал, что еще как-то белки делят не в ион-парном режиме ОФ, а просто как бы в буферах при нейтральных pH на ОФ. Читал, что на С18 БСА из смеси белков чистили в фосфатном буфере при нейтральном pH. Неужели при этом pH у БСА экспонировано достаточно гидрофобных групп, чтобы взаимодействовать с колонкой, пускай даже такой гидрофобной, как С18..? Получается так 

О пользователе

Василий's picture
User offline. Last seen 25 weeks 1 day ago. Offline
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Joined: 20/05/2009