Зависимость диапазона линейности детектора от условий разделения

Исходные данные эксперимента
Использованное оборудование: 
Прибор: жидкостной хроматограф фирмы Dionex UltiMate 3000 в составе: автосемплер - WPS-3000; насос – LPG-3400A; термостат - TCC-3000; UV-детектор - VWD-3100; Колонка C18 250×4,6 mm.

UV-детектор является самым распространенным из применямых в хроматографии типом детекторов. Его основные достоинства: широкий спектр детектируемых аналитов, простота эксплуатации и конструкции, возможность использования при градиентном элюировании и широкий линейный диапазон. Линейности эта характеристика детектора, говорящая о том, что зависимость отклика детектора (Y) от количества аналита (Х) может быть описана линейны уравнением (риунок 1).

Рисунок 1. Зависимость отклика детектора (Y) от количества аналита (Х). Х1 и Х2 -границы диапазона линейности (линейного динамического диапазона), Х3 - минимальное количество аналита, при котором исчерпывается диапазон чувствительности детектора (Ymax). Х1 часто совпадает пределом количественного обнаружения.

На рисунке красным цветом показан участок, описываемый приведенным уравнением. В большинстве методик b принято считать равным 0, в связи с чем калибровать UV-детектор можно по 1 точке внутри диапазона линейности, границы которого следует искать во время разработки метода опытным путем.

Так вот до недавнего времени я считал, что данный диапазон стабилен, если неизменными остаются следующие компоненты хроматографической системы: подвижная фаза, колонка и детектор. Но как оказалось я ошибался. На рисунке 2 представлена хроматограмма, полученная при анализе белка стандартной валидированной методикой (градиент показан пунктиром).

Рисунок 2. Хроматограмма стандарта белка по валидированной методике.

Как видно из рисунка время выхода пика белка находится в районе 28 минуты, а полное время анализа - 43 минуты. Данная методика приведена в фармакопее и предназначена для качественной и количественной характеризации конечного препарата методом ОФ ВЭЖХ. Тут вопросов нет. Но при разработке и отладке нового способа получения и очистки данного белка мне было необходимо проводить большое количество экспериментов, при этом количество анализов иногда составляло несколько десятков, которые не успевали пройти за сутки. В результате насущным сталвопрос о разработке нового более экспрессного аналитического метода на той же хроматографической системе, который возможно и не будет обладать необходимым разрешением, но позволит значительно сократить получение первичных данных, т.н. оценочный метод. Один из вариантов данного метода представлен на рисунке 3. Как видно из хорматограммы время анализа было сокращено в 1,5 раза, а время выхода уменьшилось до 19 минут. Не бог весть что, но данный метод меня в принципе устраивал, пока я не решил провести валидацию и не стал проверять его линейный динамический диапазон.

Рисунок 3. Хроматограмма стандарта белка при использовании нового, оценочного метода.

Для проверки диапазона я запустил серию анализов стандарта известной концентрации (С=2mkg/mkl) с разными объемами аналита по новой методике. Для проверки правильности работы хроматографа и последующего сравнения данных анализы с использованием нового метода я перемежал анализами фармакопейным методом и получил следующие результаты, представленные в таблице.

Таблица - характеристики пика стандарта

Интересное началось при построении калибровочной кривой (рисунок 4)

Рисунок 4. Сравнение калибровочных кривых разных методов

Из приведенного графика видно, что :

1. калибровочный график для фармакопейного метода имеет очень хорошую линейность с достоверностью выше 0,995 во всем диапазоне измерений;

2. калибровочные кривые сравниваемых методов довольно близки при малых количествах аналита, после чего чувствительность оценочного метода (характеризуется углом наклона кривой) резко падает.

В результате я сделал вывод, что возможно использовать калибровку старого метода в новом методе но только при малых количествах аналита.

Таким образом линейный динамический диапазон нового метода, отличающегося только формой градиента, значительно сократился(рисунок 5).

Рисунок 5. Изменение динамического линейного диапазона при переходе от фармакопейного к новому методу.

Но в то же время исходя из рисунка 4 можно предположить, что для нового метода участок линейного диапазона начинается с более высокого содержания аналита, уж очень сильно участок с 10 мкл похож на прямую. Для проверки данной гипотезы необходимо провести дополнительные эксперименты, но оценить  эффективность и применимость данной методики можно и без проведения дополнительной экспериментальной работы.  Для этого я по точкам, ограничивающим участок предполагаемой линейности: (10, 264) и (20, 380),  вывел уравнение калибровочной прямой, которое, если не ошибся, имеет следующий вид: Y=11.6*X+148. Построил график (рисунок 6), из которого хорошо видно, что сходимость рассчитанной прямой и участка графика в диапазоне 10-20 мкл практически идеальная, по этому критерию калибровка проходит.

Рисунок 6. Проверка сходимости калибровки и экспериментальных данных.

Но теперь обратим внимание на чувствительность получаемой методики. Чувствительность в случае линейной калибровки выражена коэффициентом b, и а данном случае равна 11,6, т.е. при  увеличении содержания образца на 2 мкг (1 мкл) (т.е. на 5-10%, в зависимости от вкола внутри диапазона) площадь пика увеличится на 11,6, при этом средняя площадь получаемых пиков в этом диапазоне больше 300, т.е. пик увеличиться не более чем на 3%, что сравнимо с инструментальной погрешностью и, следовательно, точность измерений буде слишком мала. С другой стороны чувствительность фармакопейного метода равна 35,3 (рисунок 4), что приводит к 5-10% изменеию пика при том же изменении объема (1мкл) вкола. Таким образом я считаю, что данная методика не эффективна и малочувствительна и разрабатывать ее смысла не имеет.

Таким образом, мы определили, что рамки применимости вновь разработанного хроматографического метода количественного определения белка значительно сужены относительно фармакопейного метода. Причины мне не до конца ясны, но скорее всего это связано с тем, что пик белка в новом методе "выходит" на плече более резкого градиента, что приводит к его значиельному сужению, и как следствие, число считываний детектора за время прохода пика через ячейку знаачительно снижается, в результате чего пик неправильно "прорисовывается" ("обрезается" вершина), а потом, соответственно обсчитывается. Косвенно данное предположение подтверждается тем, что между площадями пиков и их высотами очень высокий показатель корреляции (0,992). Поэтому скорее всего, увеличив частоту считывания показаний с детектора, можно будет расширить динамический диапазон, но это если припрет, а так я еще немного изменил градиент, пик стал более широкий и динамический диапазон вернулся к прежним характеристикам.

Вообщем будьте внимательны и удачи.

P.S. Если кому будет интересно найти еще какие-нибудь закономерности, то исходные данные и графики представлены в приложенном XLS - файле

Прикрепленный файлРазмер
зависимость от градиента.xls34.5 кб

О пользователе

Василий аватар
User offline. Last seen 8 недель 4 дня ago. Не в сети
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Зарегистрирован(а): 20/05/2009