Изменение времени выхода в зависимости от количества вещества на колонке

Как известно, обязательным условием идентификации вещества в хроматографии является совпадение времени выхода пика с его стандартом.  Иначе или система нестабильна, или вещества в образце нет. Я тоже так думал, но оказывается бывают исключения. Так в нашу лабораторию поступила аналитическая колонка С18, на которой определяют содержание интерферона на разных стадиях его производства. Методика фармакопейная и годами используемая. Откалибровались по стандарту (1 точка)- все идеально. Разброс по площади меньше 1%, колебания времени тоже мизерные. Но когда начали колоть образцы с разных стадий, то оказалось, что время выхода что-то гуляет. Причем иногда столь значительно, что начинаем сомневатся а интерферон ли мы вообще получаем? (Аналитики злорадно потирают руки и кричат: "Выливайте все на фиг, опять фигню какую-то "сварили".) Они "колят" же стндарт - все у них на месте.

Но мы тоже люди упертые: чего-это вдруг у нас "фигня" получилась, может у вас "фигня"!? Сели, начали разбираться и заметили одну особенность, что чем больше пик, который должен быть интерфероном, тем он раньше выходит. Решили проверить: вкололи раствор стандарта с разными объемами вкола . И точно, чем больше внесли, тем раньше время выхода(Рис.1). Причем на перегруз не похоже: форма пика правильная да и линейность калибровки сохраняется. Еще очень интересно, что теперь выравнивание происходит не по времени выхода вершины пика, а по заднему фронту пика (рис.1 и 2).

 Рисунок 1. Хроматограммы аналитической ВЭЖХ стандарта интерферона при разных объемах ввода.

 Рисунок 2. Хроматограммы аналитической ОФ ВЭЖХ интерферона при разных концентрациях аналита в образце. Как хорошо видно интерферон в образце с наибольшей концентрацией (коричневый цвет) имеет время выхода почти на 1,5 минуты раньше, чем в образце с наименьшей.

Вообщем опять "нобелевка"  грозит ;).

Резюме: надо верить в себя и в здравый смысл, а не в догмы, а что с методикой пусть аналитики сами разбираются:).

Виктор's picture

Зависимость выхода вещества от количетва

На самом деле на втором рисунке я вижу практически классичский треугольный пик. При гауссовом распределении плечи пиков равны, при треугольном пике время выхода зависит от количества образца и это всегда учитывается и корректируется вручную. В литературе это описано.

Константин's picture

Обычное дело

Обычное дело кстати,по крайней мере с углеводородами.Выравнивание то всёравно происходит по фронту...

Геннадий's picture

Действительно,

Действительно, ничего необычного. Плохая методика или колонка старая. Пики нужно поуже сделать.

Василий's picture

Колонка новая,

Колонка новая, а методика фармакопейная, так что рамки очень жесткие и ни чего менять нельзя. Понятно, что методика не оптимальна. Моей целью было показать, что иногда приходится работать и с такими методиками.

О пользователе

Василий's picture
User offline. Last seen 16 weeks 1 day ago. Offline
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Joined: 20/05/2009