Способы калибровки и контроля работы ВЭЖХ хроматографа: внутренние и внешние стандарты.

       Метод аналитической ВЭЖХ применяется в основном для определения качественного и количественного состава аналита. Достижение этих целей достигается калибровкой прибора путем заблаговременного проведения хроматографического анализа раствора одного стандарта или смеси стандартов анализируемых веществ. При правильной настройке хроматографической системы после калибровки вы можете в ручную, или автоматически определить качественный и количественный состав аналита. Недостатком данного подхода является то, что в не зависимости от характеристик хроматографической системы данные калибровок устаревают и через определенное время необходимо повторять всю процедуру. Происходить это может с различной скоростью для каждой хроматографической системы по следующим основным причиным: изменение чувствительности детекторов, замена подвижных фаз, постепенная деградация сорбента или загряхнение пор ВЭЖХ -колонки, инструментальные ошибки прибора (изменение точности вкола, скоростей потоков и т.д.). К тому же процедура колибровки зачастую занимает довольно продолжительное время (калибровка по одному стандарту (одной смеси)- до 1 рабочего дня), т.к. для достоверности получаемых калибровочных кривых необходимо осуществлять по нескольку "вколов" каждой концентрации каждого стандарта. Поэтому для повышения производительности необходимо найти способ сократить количество перекалибровок при прежнем уровне достоверности. Это достигается работой в нескольких направлениях (приготовление больших объемов буферных растворов и борьба с их упариванием, использование ососбо чистых подвижных фаз, использование предколонок, поверка хроматографа и его отдельных узлов, и т.д.). Но этого не достаточно, т.к. эти процедуры повышают воспроизводимость результатов, но не гарантируют ее и не позволяют контролировать такие критичные и мало предсказуемые параметры хроматографа, как отклик детектора и точность вкола, которые могут меняться прямо во время анализа от разных причин.
       Таким образом, существует необходимость проводить кроме планового еще и постоянный контроль работы хроматографа. Одним из самых распространенных способов оценки повседневного контроля воспроизводимости работы ВЭЖХ систем является «прокол» стандартов в рабочих концентрациях после запуска хроматографа и сравнения полученных результатов с калибровками (т.н. метод «внешнего стандарта»). При соответствии полученных результатов (площадь/высота пиков, время выхода и т.д.) калибровкам проводятся анализы, в противном случае проводится отладка работы хроматографа. При легко исправимых и прогнозируемых отклонениях после отладки работа продолжается.
Например, при использовании ОФ ВЭЖХ и НФ ВЭЖХ даже после ночного простоя хроматографа наблюдается сдвиг времени удерживания пиков из-за изменения состава подвижных фаз в следствии интенсивного испарения растворителей (следует помнить, что, зачастую, первый вкол неинформативен и ориентироваться необходимо по последующим анализам). В этом случае обычно достаточно подкорректировать соотношение ПФ в сторону увеличения концентрации растворителя. В некоторых случаях «внешний стандарт» проставляют еще и по ходу анализов, перемежая ими исследуемые образцы.
        Но данный способ тоже не лишен недостатков, т.к., во-первых, тратиться время и материалы на проведение дополнительных анализов, а во-вторых, все равно нет доказательств того, что именно в данном конкретном анализе не произошел сбой.
        Как раз для решения данной проблемы существует метод «внутреннего стандарта». Данный метод кардинально отличается от метода «внешнего стандарта» тем, что:
1.    в нем используются ВЕЩЕСТВА ЗАВЕДОМО НЕ ПРИСУТСТВУЮЩИЕ В ОБРАЗЦЕ и имеющие время удерживания, отличное от веществ, присутствующих в аналите. Причем при использовании ОДНОГО неселективного детектора время выхода стандартов должно отличаться по времени от ВСЕХ присутствующих в аналите веществ, в то время как при использовании нескольких детекторов данным требованием можно пренебречь, т.к. один детектор можно настроить на стандарты, другой - на аналит, возможны другие варианты.
2.    стандарты добавляются в ПРЯМО В ОБРАЗЕЦ аналита в известной концентрации.
        Таким образом, используя метод «внутреннего стандарта», мы можем достичь желаемого и гарантировано контролировать правильность работы прибора во время анализа.

Удачи!

Евгений Миронов аватар

Метод внутреннего стандарта

Спасибо, метод внешнего стандарта понятно и достаточно подробно описан. А вот про внутренний стандарт как-то торопливо... не очень понятно, о чем идет речь... 

Shurae аватар

Метод внутреннего стандарта

Давайте попробуем на примере.
Вам нужно определить в пробе аминокислоты, происходящие из натурального белка. Какие там есть аминокислоты, давно и точно известно. Также известно, что диаминопропионовая кислота (ДАПК) в белки не входит.
Сначала строите калибровку для каждой аминокислоты, которую нужно определять, внося в калибровочные стандарты постоянное и известное количество ДАПК, а на графике откладывая по оси Y не площадь пика определяемого компонента, а отношение его площади к площади пика внутреннего стандарта.
Когда анализируете пробы неизвестной концентрации, сначала вносите в пробу тот же самый внутренний стандартю А потом анализируете пробы, находя концентрации по тому самому градуировочному графику.

Только нужно обязательно, чтобы (1) вещества, используемого в качестве внутреннего стандарта не было в анализируемом образце и (2) если вы используете "обычные" детекторы, то чтобы пик внутреннего стандарта разделялся с другими пиками.

Мария24 аватар

Здравствуйте!а

Здравствуйте!а можно поподробнее о веществах,используемых в ВЭЖХ?есть какие то определенные или выбирать любое с подходящим временем удерживания?

Василий аватар

Здравствуйте!

Уточните пожалуйста вопрос:) Какие вещества Вас интересуют: аналиты, подвижные фазы или вообще материалы хроматографа? Что за цели, какие задачи? Конкретную задачу бы для понимания вопроса и лучше все это написать в новую тему на форуме.

Мария24 аватар

Извините за

Извините за неточный вопрос.Я имела ввиду вещества,используемые в качестве внутренего стандарта.Может быть есть список веществ,применяемых в ВЭЖХ,или хотя бы несколько самых часто используемых?с требованиям к таким веществам то все прозрачно,но мне,как неопытному специалисту несколько конкретики не хватает=)

Valeriy аватар

Внутренний стандарт.

В качестве внутреннего стандарты выбирают вещество близкое по своим физ-хим свойствам и устойчивости к аналиту (не обязательно гомолог), тяжелей его по мол массе, и ТОЧНО отсутствующее в анализируемой смеси. На хроматограмме два вещества (аналит и вн стандарт) должны расходиться с разрешением по крайней мере 2; форма пиков должна быть по возможности одинаковой (я имею ввиду асимметричность). Естественно никаких перегрузов. Желательно, если площади пиков будут одного порядка.
Ну моет еще что нибудь вспомню...

О пользователе

Василий аватар
User offline. Last seen 8 недель 4 дня ago. Не в сети
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Зарегистрирован(а): 20/05/2009