Добро пожаловать


• Вход  • Регистрация
• Забыли пароль?

Обратная связь

О фирмах

Разделы

Сорбенты

определение фосфолипидов

Уважаемые коллеги! Окажите посильную помощь, если можно. я - начинающий хроматографист, совершенно без опыта. очень нужно наладить орпделение фосфолипидов мембран методом жидкостной хроматографии. Колонка Luna C18.. если кто-нибудь может помочь информацией, помогите, пожалуйста! нужны как сами методики, так и пробоподготовка. заранее признательна

Valeriy's picture

Маловато информации...((

Уважаемая Анна!
С18... , а длина, зернение?
Насосы - изократика, градиент?
Детектор?
Стандарты?
Объект? Мембраны чего?
Производство, наука, фармацевтика?
Цель работы опишите по возможности.
Для начинающего объект сложный. Год назад на близкую задачку ушло месяца три-четыре. Методики есть, но воспроизвести - проблема, тонкости умалчивают.
Минимальные требования - градиент по полярности растворителей, возможно градиент по рН, детектор по светорассеянию (УФ не подойдет, не всякий масс подойдет). Растворители: метанол, изопропанол, ацетонитрил, ацетон. Буферы от 4 до 9 ацетатные, возможно понадобится ТХУК, триметиламин (колонка должна выдерживать рН до 10!).
У вас, как я понял, Яуза. Вы уверены что такое разделение возможно на этом приборе?
PS. Пишу "возможно", потому что объект сложный, возможны варианты состава ПФ. Всего с ходу не предусмотришь.

sakurako's picture

определение фосфолипидов

колонка Luna 5u C18(2) 100A
150*4,6 mm
particle size 5,00±0,30 µm
particle distribution 1.85±0,30 90%10%
PORE DIAMETER 100±10 A
surface area 400±0,30 m2|g
насос KNAUER изократический градиента нет
детекторы - УФ и амперметрический
стандарты будут фирмы Sigma  - для ВЖХ
объект -  мембраны эритроцитов человека
научные цели  исключительно
цель работы - установить ФЛ состав мембраны эритроцитов в норме и патологии
производители прибора уверили, что это возможно, я переписывалась с Яшиными, они утверждают, что такое возможно, но сами ФЛ не занимались.
буду благодарна за любую помощь. эта работа необходима мне, остальные методики, которые мы делае м илпнируем делать, в принципе, стандартные и есть во всех аппликациях
спасибо 

Valeriy's picture

Определение фосфолипидов.

Да, не густо.
На мой взгляд есть два существенных недостатка в конфигурации прибора, которые не позволят вам быстро решить вашу задачу, или долго долго подбирать оптимальные условия:
1) Чувствительности УФ детектора не хватит вам для получения достоверной картины состава вашего образца. Грубо говоря, вы увидите только самые большие пики. Фотометр есть фотометр. Либо вам придется вводить очень концентрированную пробу, но тут есть вероятность "убийства колонки" за счет обыкновенного перегруза или образец не растворится в подвижной фазе и сядет на старте практически навсегда (есть правило, образец должен наноситься на колонку либо в виде раствора в подвижной фазе (ПФ), либо в растворителе, максимально приближенном по свойствам (полярность, рН) к ПФ). Некоторые ФЛ поглощают в УФ так плохо что кроме маленького горбика ("прыща" - сленг) вы ничего не увидите. Как количественно оценить пик высотой 0,1% или ниже? Хорошо, если он выражен, а если просто слабая неровность фоновой линии - пик не пик, сиди думай.
2) Отсутствие градиента: любая мембрана помимо ФЛ содержит кучу всего - свободные жирные кислоты (ЖК), ацилглицериды, холестерин и его эфиры (может не так много, но все же). Сначала будут выходить ЖК, потом моно- и ди- глицериды в смеси с ФЛ, потом три-. А холестерин и его эфиры будут выходить в самом конце причем страшно неохотно. Состав прочих биожидкостей не лучше.
Градиент эту проблему решает, вопрос в программе этого градиента. С изократикой работа будет выглядеть так: делается 2-3 анализа (при условии что все условия разделения подобраны), затем все останавливается, колонка промывается растворителем с меньшей полярностью чем ПФ, затем уравновешивается заново ПФ и тд. Градиент нужен еще и для для того что бы решать эту задачу в конце анализа за 15-20 минут. При таком подходе вероятность потери колонки после первого десятка анализов очень высока.
Если проводить пробоподготовку с отделением всех мешающий факторов то перед анализом вы получите такое количество образца, которое, как я уже писал, не позволит вам увидеть полную картину ФЛ-состава.
И еще. При подборе условий разделения (состав ПФ; подбирать его придется вам вручную, мне не попадалось изократическое разделение ФЛ и иже с ними в литературе) при каждом изменении в составе ПФ вам придется проводить уравновешивание колонки 20-40 мин новой ПФ. Иначе вы не воспроизведете предыдущее разделение!

Резюме.
Есть два пути решения задачи:
1) Купить второй насос и работать с градиентом.
2) Тонкослойная хроматография. Дешево и сердито. Если денег много купите "Camag", он со сканером и аппликатором. Разделение проходит по давлением. Расшифровка и обработка данных делается на компьютере.

Если все что я написал еще не отбило желание поэкспериментировать, попробуйте ПФ чистый метанол (растворители для тай колонки должны быть соответственно for HPLC). Начните со стандартов. Получите хроматограмки - шлите на fvaleriy13*yandex.ru или выложите где нибудь, будем разбираться. Или зовите в гости, давно я в НН не был, лет тридцать )).

Успехов!
PS При всем уважению к господину Яшину (один из отцов-основателей, как ни как), думаю, что я все же прав.;))
Еще один маленький PS: Детектор! Максимальной чувствительности по всем компонентам вашей смеси можно добиться на детекторе по светорассеянию. Скорее всего покупать.

sakurako's picture

спасибо!

Спасибо вам большое. скажите, на каких условиях можно Вас пригласить "в гости"? потому что разделять страшно надо, тонкослойную налаживать в наших условиях тяжело и муторно, нет пластинок, и тп. денег тоже нет. как получать знания -  у меня нет ни малейшего представления. буду думать и читать,  пока  не пришли стандарты. можно ли с Вами еще переписываться?

Valeriy's picture

Кто ходит в гости... тот поступает мудро!

Получать знания по хроматографии можно только одним способом - через пятую точку: сидеть, читать книгу и воспроизводить на приборе.
Переписываться можно и нужно. Адрес имеется, так что буду рад помочь.
В гости лучше к нам. Напишите конечную цель вашего разделения: что вы планируете диагностировать, что бы я попробовал организовать вам экскурсию на день-два в ту лабораторию, в которой этот анализ делался год назад (делается он сейчас или нет не знаю, может прибор не работает или надобность отпала, направление деятельности поменялось). 100% уверенности что эта встреча возможна нет, но попытаться можно. В прошлом году аналогичную экскурсию провести удалось, человек захотел посмотреть как выглядит хроматограф, как работает, что может и тд (возможно он прочитает это сообщение ;)) и ему станет приятно).
Мы в Москве. Если в этой лаборатории все ОК, то можно будет попробовать что нибудь поделить у нас. Нет - значит посмотрите хроматограмки, условия пробоподготовки и разделения, нюансы, может народ на литературку расщедрится.
Посмотрите оцените свои возможности и потребности. Заодно решите, нужно ли меня звать или сами справитесь. Со мной проще, я частное безработное лицо, приехать не проблема.

А про тонкослойку вы это зря. Камаг, конечно, это страшно дорого, но у него воспроизводимость хорошая. А так, пластины, консервная банка, карандаш, линейка, реактивы для проявления и набор растворителей, ну стандарты это святое.

Пишите на почту, по моему у нас формат общения меняется.

Василий's picture

Здравствуйте.

По поводу определения фосфолипидов могу еще добавить пару копеек. Если нужно определять только классы фосфолипидов (фосфатидилэтаноламин; фосфатидилсерин; фосфатидилхолин; сфингомиелин) без определения молекулярного состава, то оптимальным является использование нормально-фазной ВЭЖХ в градинте гексан-изопропанол. Примерные хроматограммы приведены у нас в разделе теории http://www.chromatogramma.ru/book/2009/05/20/podrazdel.html . Также по данной проблеме на сайте выложены несколько статей, одна из них по адресу : http://www.chromatogramma.ru/statiya/2009/09/23/analysis-phospholipid-sp... .
Если необходимо статей могу набросать еще, только уточните пожалуйста поконкретнее Вы интересуетесь только фосфолипидами или вообше всеми липидами мембраны.
Методику для НФ ВЭЖХ тоже могу выложить.

Valeriy's picture

Помощь друга.

Вот видите, Анна, коллективный разум пришел вам на помощь. И литературой, и добрым словом готовы поддержать. Так что теперь слово за вами.

sakurako's picture

про фосфолипиды

Василий, спасибо большое! задача моя такова: сначала хотя бы  все основные классы, Вами перечисленные, которые я уже определяла для своей кандидатской, но тонкослойной хроматографией и для других нозологий. если результаты окажутся стоящими (а я абсолютно в этом уверена), то тогда   будем раскладывать мембрану вообще на составные элементы, имея в планах возможный масс-спектрометр. ну, или хотя бы еще один насос для градиента, колонки, ну и все прочее. но сперва буду пытаться получить основные фракции. Статью скачала, сейчас пойду читать. если можно выложить еще материалы. то буду бесконечно благодарна.

sakurako's picture

про фосфолипиды

Василий, спасибо большое! задача моя такова: сначала хотя бы  все основные классы, Вами перечисленные, которые я уже определяла для своей кандидатской, но тонкослойной хроматографией и для других нозологий. если результаты окажутся стоящими (а я абсолютно в этом уверена), то тогда   будем раскладывать мембрану вообще на составные элементы, имея в планах возможный масс-спектрометр. ну, или хотя бы еще один насос для градиента, колонки, ну и все прочее. но сперва буду пытаться получить основные фракции. Статью скачала, сейчас пойду читать. если можно выложить еще материалы. то буду бесконечно благодарна.

sakurako's picture

про фосфолипиды, будь они неладны

Спасибо всем большое! литература нужна всегда и везде, поэтому тоже могу поделиться чем-нибудь, если нужно.

Василий's picture

Наконец-то

Наконец-то нашел время. Сделал небольшую подборку статей по данной теме она вот тут. Статьи не только про фосфолипиды, но при разработке методов могут быть полезны, т.к.можно посмотреть разные подходы к пробоподготовке, калибровке и т.д. Также по этой теме в разделе статьи уже есть отдельно 4 статьи.

sakurako's picture

очень большое большое спасибо

Василий! Статьи скачала, буду усиленно изучать! Большое вам спасибо! 

О пользователе

sakurako's picture
User offline. Last seen 7 years 19 weeks ago. Offline
Пользователь



Настоящее имя Анна

Пол женский

Дата рождения 28/04/1979



Joined: 11/01/2012