Гель-фильтрация

В этом простейшем варианте хроматографии молекулы фракционируемых веществ не должны обладать никаким специальным срод­ством к неподвижной или подвижной фазам. Неподвижная фаза здесь представлена жидкостью, находящейся внутри пористых гранул,— точно такой же, как п жидкость подвижной фазы, проте­кающей между ними. Благодаря силам сцепления с поверхностью пространственной сетки полимера или иного пористого материала, образующего гранулы, жидкость внутри них остается неподвижной и не увлекается течением подвижной фазы. В подавляющем боль­шинстве случаев применения гель-фильтрации для биологических целей рабочей жидкостью служат водно-солевые растворы, а матери­алы   гранул   гидрофильны.

 

Переход молекул вещества из подвижной фазы в неподвижную и обратно за счет диффузии ничем не затруднен. Иная ситуация складывается внутри гранул. Здесь диффузия более или менее за­труднена из-за столкновений молекул диффундирующего вещества с нитями пространственной сетки полимера или стенками пор. Если размеры молекул соизмеримы со средним диаметром каналов в гранулах, то эти затруднения становятся весьма существенными и диффузия тормозится. Может сложиться и такое положение, когда часть внутреннего объема гранул, т. е. часть объема неподвиж­ной фазы (а иногда и весь этот объем), оказывается недоступной для молекул вещества,  растворенного   в  подвижной фазе.

Различие степени доступности объема неподвижной фазы для молекул различных компонентов исходной смеси веществ является фактором, определяющим возможность их фракционирования. Оче­видно, что оно будет происходить по размерам молекул (Рис. 1). Если в со­ставе смеси имеются очень крупные молекулы, вовсе не проникаю­щие внутрь гранул, то они будут выходить из колонки или достигать края хроматографической пластины вместе с передним фронтом подвиж­ной фазы («фронтом элюции»). В то же время мелкие молекулы, свободно диффундирующие внутрь гранул, часть времени будут находиться в неподвижной фазе. Статистически эта часть времени одинакова для всех молекул такого размера и зависит от соотношения объемов жидкости в неподвижной и подвижной фазах. Таким образом, все мелкие молекулы достигнут конца хроматографического пути более или менее одновременно и заведомо позднее, чем крупные. Молекулы промежуточных размеров, для которых из-за разброса значений еффективных диаметров пор внутри гранул неподвижной фазы до­ступна только часть ее объема, должны, очевидно, перемещаться вдоль  колонки или пластины с промежуточной скоростью.

Рис. 1. Гель-фильтрационная хроматография. Малые молекулы в об­разце могут проникать внутрь гранул, вследствие этого они протекают через колонку медленнее. Крупные молекулы, ко­торые не могут проникнуть в гранулы через поры, проходят сквозь колонку быстрее, чем более мелкие. Правильный раз­мер пор и свойства растворителя являются решающими для хорошего разделения.

Это явление первоначально было названо «гель-фильтрацией», поскольку в качестве пространственной сетки использовали поли­мерные гели. Однако эти гели относительно легко деформируются и для хроматографии при высоком давлении непригодны, поэтому их стали заменять жесткими материалами, в частности пористым стеклом и силикагелем. Иногда для этого варианта хроматографии вводят термин «эксклюзивная хроматография» («exclusion» — исклю­чение; имеется в виду исключение из гранул крупных молекул). Поскольку сейчас силикагель явно вытесняет пористое стекло, мы сохраним для рассматриваемого варианта хроматографии прежнее название — гель-фильтрация.

Очевидно, что размеры молекул связаны с их массами, но отнюдь не целиком ими определяются. Это особенно важно учитывать в случае макромолекул, размеры которых могут существенно зави­сеть от плотности упаковки полипептидной или полинуклеотидной цепи. В ограничении свободы диффузии через пространственную сетку пор внутри гранул немалую роль может играть и форма моле­кулы. Очевидно, что сферическая глобула будет диффундировать иначе, чем молекула такого же объема, но вытянутая в виде палочки.

Как во всех хроматографических разделениях излишняя длина колонки приводит к размыванию пика (Рис. 2).

Рис. 2. Уширение полос в колон­ке из-за чрезмерной длины колон­ки. Так называемая эффективная часть колонки является достаточной для разделения. Слишком длинные колонки не улучшают очистку, но вызывают разбавление образца из-за уширения полос.

 

Гель-фильтрационная хроматография является также вспомогатель­ным методом для оценки молекулярной массы молекул (рис. 2.11). Несмотря на то, что для этого существуют гораздо более точные мето­ды, например, масс-спектрометрия, гель-фильтрация ока­зывается полезной для измерения равновесий мономер-мультимер при микромолярных (мкМ) концентрациях биомолекул (Рис. 3).


  Рис.3. Молекулы с известной молекулярной массой дают возмож­ность оценить молекулярную массу неизвестной молекулы. В данном случае для исследуемой молекулы наблюдаются два пика, что указывает на равновесие мономер-димер.

Пористые материалы для гель-фильтрации чаще всего выпускают­ся в виде сферических гранул целого набора диаметров с различными средними размерами пор.