Теория хроматографии


 

 

Хроматография - это не наука, а - искусство!
Народная мудрость.
Хроматография [гр. сhrömatos − цвет + graphö − пишу] — метод разделения, анализа и физико-химических исследований веществ, основанный на перемещении зоны вещества вдоль слоя сорбента в потоке подвижной фазы с многократным повторением сорбционных и десорбционных актов. При этом разделяемые вещества распределяются между двумя несмешивающимися фазами (в зависимости от их относительной растворимости в каждой фазе): подвижной и неподвижной.
Данный раздел нашего сайта предназначен для первоначального ознакомления с теоретическими и практическими основами хроматографии. Для этого мы постарались в доступной и наглядной форме изложить такие важные для лучшего понимания этой нтереснейшей науки разделы, как: терминология хроматографии, классификация хроматографических методов, основа хроматографической теории, основные аспекты практического применения различных хроматографических методов и т.д. Для более углубленного изучения хроматографии советуем воспользоваться литературными источниками, приведенными в списке используемой литературы, а также архивом книг и статей, расположенном на нашем сайте.

История и определение хроматографического метода

Цвет М.С. (1872-1919 г.г.)
Цвет М.С. (1872-1919 г.г.)

 

ВВЕДЕНИЕ

                            

Впервые термин "хроматография" был использова российским биологом Михаилом Семеновичем Цветом для описания разработанного им метода разделения компонентов хлорофила на бумаге. Это произошло 21 марта 1903 г ., когда  Михаил Семенович Цвет, в то время работавший в должности ассистента (официально - в должности внештатного лаборанта) кафедры анатомии и физиологии растений Варшавского университета, прочитал свой знаменательный доклад "О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биологическому анализу" (Труды Варшавского общества естествоиспытателей. Отд. биологии. 1903. Т. 14. С. 1-20). Эксперименты в области адсорбции, приведшие в итоге к открытию хроматографии, ученый начал двумя годами раньше - в возрасте 28 лет. Подробное изложение принципов и возможностей своего хроматографического метода он дал в 1906 г . в двух статьях на немецком языке и в книге 1910 г . "Хромофиллы в растительном и животном мире".

По экспертным оценкам, хроматография относится к 20 выдающимся открытиям прошедшего столетия, которые в наибольшей степени преобразовали науку, а через нее определили уровень развития техники и промышленности, цивилизации в целом. Хотя по образованию и роду занятий Цвет был ботаником, результаты его открытия столь значимы для всех естественных наук, что Федерация европейских химических обществ, например, приводит имя Цвета, наряду с четырьмя другими русскими именами - Ломоносова, Менделеева, Бутлерова и Семенова, - в числе ста выдающихся химиков прошлого.

В конце своего 100-летия хроматография представляет собой:

самый распространенный и совершенный метод разделения смесей атомов, изотопов, молекул, всех типов изомерных молекул, включая и оптические изомеры, макромолекул (синтетических полимеров и биополимеров), ионов, устойчивых свободных радикалов, комплексов, ассоциатов, микрочастиц;

уникальный метод качественного и количественного анализа сложных многокомпонентных смесей:

самостоятельное научное направление и важный физико-химический метод исследования и измерения;

препаративный и промышленный метод выделения веществ в чистом виде;

мощную отрасль научного приборостроения.

Ни один аналитический метод не может конкурировать с хроматографией по универсальности применения и эффективности разделения самых сложных многокомпонентных смесей. На современных газохроматографических капиллярных колонках в одном эксперименте могут быть разделены, количественно и качественно определены более 1000 индивидуальных компонентов, например, в бензиновых фракциях нефти; двумерный электрофорез позволяет увидеть до 2000 белков в биологических объектах или пептидов в гидролизатах белков. Только благодаря сочетанию разнообразных методов хроматографии и капиллярного электрофореза стала возможной расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК и завершение работ по программе "Геном человека". Используя хроматографию, можно определить содержание супертоксикантов, в частности, полихлорированных диоксинов в объектах окружающей среды при крайне низких концентрациях этих веществ (10-10%).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХРОМАТОГРАФИИ

Хроматография изучает термодинамику состояния двухфазных систем газ-жидкость, жидкость-жидкость, жидкость-твердое тело, сверхкритическое и жидкокристаллическое состояние веществ, исследует природу межмолекулярных взаимодействий, кинетику процессов внутреннего и межфазного массообмена, процессы комплексообразования, ассоциации и образования соединений включения, стереохимию органических соединений и многое другое.

В связи с исключительной многогранностью понятия "хроматография" оно не может быть охвачено одним единственным определением. В категориях "явление, процесс, метод, наука" хроматографию предложено определять как

явление образования, движения и изменения концентрационных зон веществ (частиц) в условиях массообмена между несмешивающимися и движущимися относительно друг друга фазами или на границе раздела этих фаз;

процесс дифференцированного многократного перераспределения веществ или частиц между несмешивающимися и движущимися относительно друг друга фазами, приводящий к обособлении) концентрационных зон индивидуальных

компонентов исходных смесей этих веществ или частиц;

метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различии в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз;

наука о межмолекулярных взаимодействиях и переносе молекул или частиц в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз.

В научной литературе встречаются и другие определения хроматографии, однако любое из них должно обязательно содержать среди отличительных видовых признаков упоминание о переносе веществ (частиц) в системе несмешивающихся и движущихся друг относительно друга фаз. Наличие как минимум двух фаз и их относительное движение, то есть динамика процесса, -неотъемлемые признаки хроматографии.

В общем случае хроматография это наука о принципах и методах разделения, количественного и качественного определения веществ, используя их различия (размер, заряд, массу, полярность и т.д.) в потоке на границе нескольких гетерогенных сред (газ и твердое тело, жидкость и твердое тело, газ и жидкость, несмешиващиеся жидкости и т.д.).

В связи с многогранностью данной науки существует несколько классификаций методов хроматографического разделения окоторых более подробно написано в разделе Классификация методов хроматографии.

 

 Рисунок 1 Пример жидкостной хроматографии смеси стандартов синтетических фосфолипидов (1) и образца грубого липддного экстракта из клеточной мембраны эритроцитов человека(2) на нормально фазной колонке при детектировании лазерным светорассеивающим детектором.НЛ – нейтральные липиды; ФЭ – фосфатидилэтаноламин; ФС – фосфатидилсерин; ФХ – фосфатидилхолин; СМ – сфингомиелин.

 

Рисунок 2. Пример газовой хроматографии: скоростной анализ паров взрывчатых веществ на поликапиллярной колонке при температуре 170°С.
Поликапиллярная колонка длиной всего 22 см позволяет за 2.5 минуты обнаружить и идентифицировать следовые количества паров взрывчатых веществ: 1 - 2,6-динитротолуол, 2 - 2.4-динитротолуол. 3 - 2,4,6-тринитротолуол, 4 - 3,4,5-трининитротолуол, 5 - 2.3,4-тринитротолуол, 6 - гексоген. 7 - тетрил.

 

Развитие хроматографии

Разделение в хроматографической колонке является важнейшей, но предварительной операцией всего процесса газохроматографического анализа. Вышедшие из колонки, как правило, бинарные смеси (газ-носитель - компонент) попадают в детектирующее устройство. Здесь происходит преобразование изменений концентраций компонентов во времени в электрический сигнал, регистрируемый при помощи специальной системы UK LLP formation в виде кривой, называемой хроматограммой. Результаты всего опыта в значительной степени зависят от правильного выбора типа детектора, его конструкции. Существует несколько классификаций детекторов. Различают дифференциальные и интегральные детекторы. Дифференциальные детекторы регистрируют мгновенное значение одной из характеристик (концентрации или потока) во времени. Интегральные детекторы суммируют количество вещества за определенный промежуток времени. Также применяют разнообразные по принципу действия, чувствительности и назначению детекторы: термокондуктометрические, ионизационные, спектроскопические, масс-спектрометрические, кулонометрические и многие другие.

Применение газо-адсорбционной хроматографии

Газо-адсорбционная хроматография используется в химической и нефтехимической промышленности для анализа продуктов химического и нефтехимического синтеза, состава фракций нефти, определения чистоты реактивов и содержания ключевых продуктов на разных стадиях технологических процессов и т.п.

Анализ постоянных газов и легких углеводородов, включая изомеры, методом газовой хроматографии занимает 5 - 6 минут. Раньше, на традиционных газоанализаторах, этот анализ длился 5 - 6 часов. Все это привело к тому, что газовая хроматография стала широко использоваться не только в научно-исследовательских институтах и контрольно-измерительных лабораториях, но и вошла в системы комплексной автоматизации промышленных предприятий.

Сегодня газовая хроматография применяется и при поиске нефтяных и газовых месторождений, позволяя определять в отобранных из почв пробах содержание органических веществ, указывающих на близость нефтяных и газовых месторождений.

Газовая хроматография успешно применяется в криминалистике, где с ее помощью устанавливают идентичность образцов пятен крови, бензинов, масел, подделку дорогостоящих пищевых продуктов и т.п. Очень часто газовая хроматография применяется для определения содержания спирта в крови водителей автомобилей. Несколько капель крови из пальца достаточно, чтобы узнать, сколько, когда и какой спиртной напиток он выпил.

Газовая хроматография позволяет получать ценную и уникальную информацию о составе запахов пищевых продуктов, таких, как сыр, кофе, икра, коньяк и др. Иногда информация, получаемая газохроматографическим анализом, нас не радует. Например, нередко в пищевых продуктах обнаруживается излишнее количество пестицидов или фруктовый сок содержит трихлорэтилен, который вопреки запретам использовали для повышения степени извлечения каротина из фруктов и т.д. Но именно эта информация защищает здоровье человека.

Впрочем, нередки случаи, когда полученной информацией люди просто UK LLP пренебрегают. В первую очередь это относится к курению. Детальный газохроматографический анализ давно установил, что дым сигарет и папирос содержит до 250 различных углеводородов и их производных, из которых около 50 обладают канцерогенным действием. Именно поэтому у курильщиков рак легких встречается в 10 раз чаще, но по-прежнему миллионы людей продолжают отравлять себя, своих коллег и родственников.

Газовая хроматография находит широкое применение в медицине для определения содержания многочисленных лекарственных препаратов, определения уровня жирных кислот, холестерина, стероидов и т.д. в организме больного. Такие анализы дают чрезвычайно важную информацию о состоянии здоровья человека, ходе его болезни, эффективности использования тех или иных лекарств.

Научные исследования в металлургии, микробиологии, биохимии, в разработке средств защиты растений и новых лекарственных препаратов, в создании новых полимеров, строительных материалов и во многих других самых различных областях практической деятельности человека невозможно себе представить без такого мощного аналитического метода, как газовая хроматография.

Газовая хроматография успешно используется для определения содержания полициклических ароматических соединений, опасных для здоровья человека, в воде и в воздухе, уровня бензина в воздухе помещений автозаправочных станций, состава выхлопных газов автомобилей в воздухе и т.д.

Этот метод широко используется как один из основных методов контроля чистоты окружающей среды.

Газовая хроматография занимает важное место в нашей жизни, обеспечивая нас колоссальным объемом информации. В народном хозяйстве и в научно-исследовательских организациях используется более 20 тыс. самых различных газовых хроматографов, которые являются незаменимыми помощниками при решении многих сложных задач, ежедневно возникающих перед исследователями и инженерами.

Теоретические основы хроматографии

При написании раздела данного в качестве основного источника были использованы книги  описывающие теорию на примере жидкостной хроматографии, в связи с этим следует учитывать эту специфику.

 Навигация

Принципы и основы теории хроматографии

 

Основные элементы хроматографического процесса рассмотрим на примере разделе­ния бинарной смеси в условиях колоночной жидкостной адсорбционной хроматографии. Представим себе трубку, заполненную простым адсорбентом (колонку), через которую не­прерывно течет растворитель (рис. 1.)

Рис 1 Хроматографическая колонка


Адсорбент (сорбент, наполнитель колонки) удерживается в колонке фильтрами, он неподвижен и поэтому называется неподвижной фазой. Растворитель, перемещающийся от­носительно сорбента, называется подвижной фазой (в некоторых случаях элюентом). Введем в верхнюю часть колонки по одной молекуле соединений - сорбатов, обозначенных да­лее Х и У (рис. 2). При движении вдоль колонки эти молекулы будут диффундировать внут­ри пор сорбента и, в результате межмолекулярных взаимодействий того или иного типа, адсорбироваться на поверхности неподвижной фазы.

 

         Время, в течение которого молекулы находятся в адсорбированном состоянии, определяется силой межмолекулярного взаимодействия сорбатов Х и У с сорбентом. При очень слабой сорбции молекулы почти все время проводят в растворе подвижной фазы и поэтому переме­щаются вниз по колонке со скоростью, лишь незначительно уступающей скорости движения подвижной фазы. Наоборот, при очень сильной сорбции молекулы Х и У почти не отрыва­ются от поверхности и скорость их перемещения по колонке незначительна.

        С точки зрения хроматографии нас больше всего интересуют такие условия, в кото­рых сила адсорбции промежуточная и скорость перемещения Х и У по колонке в 2-10 раз меньше скорости движения подвижной фазы. Явление замедленного движения молекул Х и У относительно движения подвижной фазы в хроматографии называется удерживанием. Ес­ли константы сорбции веществ Х и У различны, то различным будет и их средняя скорость движения по колонке. Молекулы Х в нашем примере сорбируются слабее, при движении по колонке обгоняют молекулы У и из колонки они выйдут в разные моменты времени. Таким образом, достигается основная цель хроматографии -разделение.

       Естественно, что на практике в колонку не вводят единичные молекулы и поэтому данная картинка предельно упрощает реальную ситуацию. Если в колонку введены хотя бы несколько молекул разного вида, то обнаружим, что средние скорости перемещения молекул X и У по-прежнему различны. Помимо этого, скорости перемещения отдельных молекул каждого вида отклоняются в ту или иную сторону от среднего для данного вида значения. Молекулы сорбатов , первоначально введенные в колонку в виде мгновенного импульса, выходят из нее более продолжительно, это объясняется тем, что в ходе хромато­графической миграции каждое индивидуальное вещество переме­щается в направляющей системе в ограниченном (постепенно изме­няющемся) объеме. Эти объемы и соответствующие им участки длины колонки, равно как пятна и полосы на хроматографической пластин­ке, будем ниже именовать. хроматографическими зонами, или просто зонами. Неидентичность скоростей перемещения одина­ковых молекул в хроматографии называется размываниемОно связано с рядом явлений в колонке, которые подробнее рассмотрим позднее. Это нежелательное явление приводит к тому, что среди молекул У могут находиться также молекулы Х, скорость которых близка к скорости наиболее "быстрых" молекул У. В результате зоны Х и У могут частично наложиться одна на другую и разделение окажется неполным.

       Процессы удерживания и размывания - предмет теории хроматографии.

       Некоторые основные термины и определения.

       Хроматограмма - кривая, изображающая зависимость концентрации соединений, вы­ходящих из колонки с потоком подвижной фазы, от времени с момента начала разделения (рис. 3).

         Рис3.

        Базовая линия соответствует тому промежутку времени, в течение которого детектор регистрирует сигнал только от подвижной фазы.

        Пик - кривая, в идеале приближающаяся к кривой гауссова распределения, описывает постепенное нарастание концентрации на выходе из колонки и последующем ее уменьше­нии.

        Время появления максимума пика на хроматограмме называется временем удержива­ния tr.

        При постоянных условиях работы и составе фаз хроматографической системы время удерживания является величиной постоянной для данного вещества. Иногда в начальной части хроматограммы регистрируется пик, природа которого связана с кратковременным на­рушением равновесия в колонке при вводе пробы. Этому пику соответствует время удержи­вания несорбируемого вещества to.

        Время удерживания также определяется скоростью подачи через колонку подвижной фазы v. Удерживаемый объем (объем эллюции зоны) данного вещества рассчитывается по формуле:

                 Vn=tn*v            (1)

  и не зависит для данной колонки от расхода.

            Параметр коэффициент емкости данного соединения в данной хроматографической системе рассчитывается по формуле:

            K=(tr-to)/to         (2)

        Этот параметр не зависит от размеров колонки и скорости потока и широко использу­ется в хроматографической литературе и работах. Физический смысл данного важнейшего коэфициента, еще называемого в литературе коэффициентом распределения двояк:
      во-первых, К=Мs/Mm, где Мs - масса (количество) сорбированного вещества, Mm - масса (количество) вещества находящегося в подвижной фазе в равновесии с сорбированным веществом (Мs);
      во-вторых, время элюции зоны tr в (1 + Кr) раз больше, чем to, а т.к. Vr=tr*v, то удерживаемый объем Vr в  (1 + Кr) раз больше, чем Vo.

      Для лучшего понимания  проиллюстрируем  значение K на описании миграции (хроматографической) зоны.

  

       Миграция зоны

 
        Представьте себе, что в описанную выше колонку с того же кон­ца, где находится исходная хроматографическая зона, начинают подавать элюирующую жидкость. Разумеется, второй конец колонки при этом открыт так, что жидкость между гранулами по всей ее длине приходит в движение. Как поведет себя зона? Будем пока по-прежнему пренебрегать продольной диффузией. На переднем по течению жидкости крае зоны подвижная фаза, покидая область равновесия, начнет поступать в прилежащий участок колонки, где неподвижная фаза еще свободна от вещества. Молекулы последнего начнут диффундировать внутрь гранул неподвижной фазы, и будет устанавливаться новое равновесие между подвижной и неподвиж­ной фазами на этом участке. Распределение между фазами, как и ранее, будет определяться соотношением степеней сродства вещества к каждой из фаз, т. е. коэффициентом распределения К. Зона начнет расширяться, однако концентрация вещества в присоединяющемся спереди участке будет ниже, чем в исходной зоне, так как в этот участок поступает только то количество вещества, которое раньше содержалось в подвижной фазе такого же (по длине колонки) участ­ка. В это же время из точно такого же по длине колонки участка, находящегося в конце зоны, подвижная фаза уходит вперед, а на ее место поступает чистый элюент. И здесь происходит равновесное перераспределение, на этот раз за счет вещества, прежде находив­шегося в неподвижной фазе, которое теперь частично десорбируется. Общая концентрация вещества в этом «арьергардном» участке зоны, очевидно, тоже начинает уменьшаться. В остальных участках, на которые можно мысленно разбить исходную зону, уходящая вперед подвижная фаза замещается точно таким же раствором подвижной фазы, поступающим из расположенных сзади участков, и равнове­сие не нарушается.

      Описанные явления будут развиваться дальше. На следующий по ходу течения жидкости участок колонки будет поступать уже обедненная подвижная фаза, и новое равновесное распределение здесь пойдет в условиях еще меньшей концентрации вещества. В это же время на предыдущем (только что рассмотренном) участке переднего фронта произойдет замена обедненной было подвижной фазы на полноценную, поступившую из исходной зоны, и концентра­ция вещества на этом участке повысится. Тем временем на концевом участке зоны замена уже обедненной подвижной фазы новой пор­цией элюента приведет к дальнейшему снижению суммарного коли­чества вещества. Наконец, соседний, лежащий впереди участок тоже начнет истощаться в результате замены полноценной под­вижной фазы на обедненную, поступившую из концевого участка зоны.       В результате «центр тяжести» зоны сместится вперед, в то время как зона в целом начнет как бы «расплываться». Нам важно как-то оценить эту скорость смещения и характер расширения зоны и представить себе,   как   они    зависят   от   условий   хроматографии.

        Идти дальше по пути словесного описания явлений слишком слож­но, поэтому воспользуемся введенным выше приемом представления хроматографических зон с помощью диаграмм.

 

Рис. 4. Сопоставление характера миграции хроматографических зон для двух веществ, отличающихся между собой по степени   сродства   к  неподвижной   фазе   (см.   текст)

       На рис. 4 слева вверху представлена исходная зона, для которой К = 1 (заштрихованный и незаштрихованный участки диаграммы одинаковы). Описанные выше перераспределения вещества возникают сразу же, как только подвижная фаза начинает покидать исходную зону, и происходят непрерывно. Такую ситуацию наглядно иллюстрировать трудно. Воспользуемся обычным приемом математического анализа. Пред­ставим себе вначале, что процесс идет скачкообразно, а затем будем постепенно уменьшать величины скачков до тех пор, пока не при­близимся (в пределе) к естественному плавному течению хроматографического процесса. Для наглядности «скачки» на рис. 4 выбраны максимальными — на всю ширину хроматографической зоны. Во­образим, что вся подвижная фаза исходной зоны мгновенно пере­мещается на соседний участок колонки (ширина зоны сразу удваи­вается), а затем остается там до тех пор, пока на обоих участках за счет поперечной диффузии не установится равновесие. Результат этого скачка представлен диаграммой во второй строке левого столбца. Легко понять, что для выбранного характера распределе­ния между фазами (К = 1) оба участка будут выглядеть одинаково и на каждом из них будет находиться половина исходного материала зоны, поровну распределенного между неподвижной и подвижной фазами.
 
      Сделаем теперь второй такой же скачок, т. е. мгновенно перемес­тим всю подвижную фазу колонки еще на один объем, равный объему исходной зоны, и снова подождем установления равновесия. Рас­суждая, как описано выше, легко убедиться в том, что теперь зона приобретает форму, представленную третьей строкой левого столб­ца на рис. 4. Предоставим читателю проверить, что, двигаясь таким образом шаг за шагом, можно получить всю серию из восьми распо­ложенных одна под другой диаграмм, наглядно иллюстрирующих миграцию и расширение зоны для нашей еще очень грубой модели хроматографического процесса при К = 1. Стрелками на диаграм­мах отмечены положения центра тяжести зоны, вертикальными ли­ниями — положения ее переднего фронта. Строго говоря, зона рас­тягивается на весь объем от начала колонки до переднего фронта зоны, но при этом на обоих концах зоны оказывается так мало ве­щества (в нашем примере концентрация снижается в 27, т. е. в 128 раз), что реальная хроматографическая зона уходит от начала колонки и отстает от фронта течения элюента.
 
      Теперь выясним роль выбора значения К. В правом столбце рис. 4 представлены результаты аналогичного графического анализа процесса миграции зоны для К = 3. Исходную общую загрузку зоны (высоту столбца диаграммы в первой строке) оставим без из­менения. Уже после первого скачка, как видно из сопоставления диаграмм второй строки, появляется существенное отличие харак­тера трансформации зоны. Теперь она уже отнюдь не однородна, хотя и стала вдвое шире. Подвижная фаза вынесла вперед лишь 1/4 вещества исходной зоны; здесь оно распределяется между фазами также в отношении 1 : 3. Соответственно участок исходной зоны лишился только 1/4 части своего содержимого, и после перераспре­деления вещества со свежей порцией элюента его диаграмма еще не очень сильно отличается от исходной. Проделав аналогичную манипуляцию еще шесть раз, мы приходим к результату, представ­ленному последней строкой правого столбца, который можно сопо­ставить с тем же этапом «элюции» в предыдущем случае. Это со­поставление позволяет сделать важный качественный вывод: с уве­личением степени сродства вещества к неподвижной фазе движение хроматографической зоны замедляется!
   Фундаментальный факт замедления скорости миграции зоны с увеличением К лежит в основе любого варианта хроматографического фракционирования смеси веществ. После анализа, проведен­ного с помощью следующего рисунка, читатель сможет убедиться в том, что скорость миграции центра зоны не зависит от выбора ве­личины скачков модельной системы. Из этого следует, чго сделанный вывод сохраняет свою силу и для реального хроматографического процесса.
      Кривыми в последней строке рис. 4 обозначены сглаженные «профили» зон для двух сопоставляемых случаев хроматографиче­ской элюции. Внизу эти профили совмещены на длине колонки. Такая картина может быть получена при внесении в исходную зону смеси двух веществ с различными коэффициентами распределения (К = 1 и К = 3). Существо проведенного рассмотрения позволяет заключить, что расхождение зон будет тем заметнее, чем сильнее отличаются между собой значения К для двух компонентов смеси или, что то же, чем сильнее они различаются по степени сродства к неподвижной фазе. Проведя соответствующие измерения, легко убедиться в том, что отношение расстояния, пройденного передним фронтом элюента (вертикальная линия), к расстоянию, пройденному центром тяжести зоны (стрелка), если отсчитывать их от начала ко­лонки, для левого столбца (К = 1) равно двум, а для правого (К = 3) постепенно приближается к четырем. Оба эти отношения можно представить в виде суммы 1+ К. Далее мы увидим, что это отнюдь не случайно.

     Тем, кто знаком с методами хроматографии, полученная картина напоминает типичное разделение хроматографических «пиков», достаточно, впрочем, плохое из-за их непомерного расширения. Однако такое расширение обусловлено не существом метода, а лишь несовершенством модели грубых скачков, что не принципиально и будет верно при любой степени дисктности модели.

    При этом величина отставания зоны от фронта элюции останется неизменной — она зависит только от коэффициента распределения вещества между фазами. Таким обра­зом, даже это первое, довольно грубое рассмотрение процесса хрома-тографической элюции позволяет сделать два практически важных заключения. Во-первых, зона вещества будет двигаться вдоль ко­лонки тем медленнее, чем сильнее выражено сродство этого вещест­ва к неподвижной фазе сорбента.         Во-вторых, во избежание расши­рения зоны элюцию надо проводить достаточно   медленно.
      В заключение анализа динамических моделей отметим, что три кривые распределения — суммарного количества вещества вдоль зоны и его количества в неподвижной и подвижной фазах - строго подобны, так как в любом сечении зоны равновесные соотношения между ними определены значением К. Это позволит нам далее гово­рить о форме и характере движения вдоль колонки хроматографической зоны в целом, имея в виду суммарное количество содержа­щегося в ней вещества, тем более что в момент вытекания из колонки (сбора фракций) это вещество выходит в виде раствора суммар­ной концентрации, которая из-за отсутствия в пробирках коллек­тора фракций неподвижной фазы уже никак изменяться не будет. Зона при этом не деформируется, так как судьба впереди идущего, покидающего колонку участка зоны не может повлиять на характер элюции следующих за ним участков.
    Рассмотрим теперь подробнее форму реально мигрирующей зоны, т. е. характер распределения вещества вдоль нее. В нижней части рис. 4 диаграммы, очерчивающие профили зоны, аппроксимированы плавными кривыми. Известно, что реальные хроматографические пики имеют колоколообразную форму.     Теория показывает, а опыт подтвер­ждает, что эта форма может быть хорошо представлена математиче­ской зависимостью, играющей центральную роль в теории статисти­ческих процессов, так называемым «распределением Гаусса». Нам не­обходимо познакомиться с особенностями этой зависимости поближе. 
   

  Распределение Гаусса

Рассмотрим    математическую   функцию   у = f (х)   вида
 
где А — некий постоянный множитель, а — постоянный параметр, е — основание натуральных логарифмов (е ≈2,718) и X'— фикси­рованное значение аргумента х. Легко видеть, что для всех значений х, сильно отличающихся от х', когда модуль разности | х — X'|>> а,величина у →0.
При х = х' функция имеет максимум:  
 

  Наконец, если | х — X'|=а, то:

 

 

    График такой функции представлен на рис. 5. Он представляет собой колоколообразную кривую именно такого вида, какой был рассмотрен выше для огибающей симметричной хроматографической зоны. Если представить себе, что колонка расположена вдоль оси X, а ее начало совпадает с точ­кой х = 0, то рис. 5 иллюстри­рует ситуацию, когда исходная зона продвинулась на расстояние х' и несколько «расплылась».

 Рис.5 Расрпеделение Гаусса.
 
     Выясним теперь смысл пара­метра а и множителя А. Из гра­фика ясно, что величиной а можно характеризовать степень «расплывания» функции (хроматографической зоны). Чем больше а, тем график становится шире и ниже. Если проинтегрировать функцию распределения Гаусса вдоль всей оси X, т. е. определить площадь, ле­жащую под кривой, то получается, что она равна просто А (для того чтобы получить этот удобный результат, в функцию был введен множитель (2п)-0,5). Таким образом, множитель А характеризует площадь под кривой. Замечательно, что результат интегрирования не зависит от а. Как бы ни «расплывалась» кривая распределения Гаусса за счет увеличения а, ограниченная ею площадь остается неизменной. Но это как раз то, что нам нужно для описания мигра­ции хроматографической зоны, если под А понимать суммарное ко­личество вещества в зоне. Величину а принято называть полушириной кривой Гаусса, т. е. характеризовать ширину всей кривой величиной 2а, измеренной на высоте у = 0,607 ymax. Действительно, если надо как-то условиться о характеристике ширины плавной кривой такого вида, то указан­ный выбор можно признать вполне удачным — в симметричный интервал 2а попадает основная часть площади, лежащей под кривой. Кроме того, тем самым практически указывается и максимальная ширина кривой у основания — построение показывает, что ее можно принять равной 4а, пренебрегая малозначащими «хвостами» функ­ции, лежащими вне этого интервала. Размерность а совпадает с раз­мерностью аргумента распределения Гаусса. Для распределения ве­щества вдоль хроматографической зоны — это размерность длины. Для распределения, изменяющегося со временем, а может иметь размерность времени.
    Поскольку кривая Гаусса в теории вероятностей описывает отклонения от среднего значения некоей величины, подверженной флюктуациям, и в частности разброс ошибок измерения, то вели­чину а нередко именуют стандартным отклонением (standard deviation). Квадрат этой величины (а2) называют дисперсией (vari­ance). Нас будет особо интересовать именно дисперсия ввиду сле­дующего замечательного свойства распределения Гаусса, которое можно доказать методами теории вероятностей. Если имеется любое число i физических факторов, влияние каждого из которых на форму распределения может быть учтено и описано величиной аi, то сово­купное воздействие всех этих факторов сохраняет форму распреде­ления Гаусса, для которого величина стандартного отклонения а оказывается   связанной   с ai   зависимостью:
 
    Иными словами, при совокупном воздействии нескольких фак­торов, ведущих к случайным отклонениям от средней величины, суммируются не стандартные отклонения, а дисперсии. Однако мы еще отнюдь не доказали, что профиль хроматографической зоны действительно имеет форму распределения Гаусса. Доказательство такого предположения может быть получено, если удастся записать общее уравнение миграции зоны, учитывающее все физические фак­торы, влияющие на ее форму, решить его и показать, что это решение имеет приведенную выше структуру функции у = f(х). Это действи­тельно удается сделать, как будет показано в следующем параграфе.
 

Уравнение движения хроматографической зоны

    Это уравнение, а тем более его решение достаточно сложны, и приводить их здесь не имеет смысла. Читатель может найти соот­ветствующий материал в фундаментальных монографиях и специальной литературе. Мы ограничимся общими замечаниями о том, как такое уравнение составляют и какие физические параметры реального хроматографического процесса в нем стараются учесть, затем приведем решение этого уравнения и проанализируем вытекающие из него практически важные особенности поведения хроматографиче-ской зоны в ходе ее миграции вдоль колонки.

    При составлении уравнения движения учитывают следующие физические особенности реального хроматографического процесса, приводящие к расширению зоны: 1) неоднородность тока жидкости в подвижной фазе (например, между гранулами могут образовы­ваться каналы, где жидкость течет быстро, или же могут формиро­ваться застойные зоны); 2) продольную диффузию молекул вещества в подвижной фазе; 3) продольную диффузию вещества в неподвиж­ной фазе; 4) неравновесность распределения вещества на границе сорбирующей поверхности в неподвижной фазе; 5) неравновесиость распределения вещества по объему подвижной фазы; 6) неравновес­ность распределения вещества по объему жидкости в неподвижной фазе (внутри гранул или в слое жидкости, сорбированной на их поверхности). Для упрощения записи условимся далее теми же циф­рами обозначать параметры зоны, отражающие воздействие перечис­ленных факторов, т. е. слагаемые суммарной дисперсии зоны. Каж­дый из упомянутых физических процессов является статистическим по своей природе и, действуя отдельно, вызывает расширение зоны, подобно тому как это было показано ранее с помощью диаграмм, где, по существу говоря, объединилось действие всех факторов не­равновесности распределения вещества (факторы 4—6). Воздействие каждого из процессов можно характеризовать величиной обуслов­ленного им стандартного отклонения стг, а их совместное действие приведет к стандартному отклонению а, которое можно подсчитать, суммируя соответствующие дисперсии:

 

      При составлении первого уравнения движения зоны предпола­гают, что в начальный момент времени t= 0 на колонку длиной L вносят в виде очень тонкого слоя конечную массу вещества М и немедленно начинают элюцию так, что подвижная фаза перемещается вдоль колонки с линейной скоростью и, которую условимся называть скоростью элюции. Далее рассматривают бесконечно тонкий слой внутри зоны в момент t, когда максимум ее находится на расстоянии х от начала колонки. Для этого слоя составляют дифференциальное уравнение баланса, имея в виду, что скорость изменения количества вещества в неподвижной и подвижной фазах слоя (суммарно) обус­ловлена разностью потока вещества на границах слоя в обеих фазах с учетом диффузии. В таком уравнении фигурируют две функции, например концентрации вещества в подвижной фазе (Ст) и непо­движной фазе (Cs), и два аргумента, неявно связанные между собой,— х и t. С помощью второго уравнения, описывающего переход вещест­ва из одной фазы в другую, первое уравнение можно преобразовать так, что оно будет записано только для одной функции, например Ст. Интересуясь формой зоны в тот момент, когда она подходит к концу колонки, можно положить х = L. Тогда получается диф­ференциальное уравнение для   Ст = f (t), т. е. описание того, как изменяется концентрация вещества на конце колонки. Можно пред­видеть, что эта концентрация будет равна нулю в течение некоторого времени, пока зона движется по колонке, затем будет нарастать, пройдет максимум и снова упадет до нуля в тот момент, когда зона покинет  колонку. Уравнение удается решить, и его решение действительно имеет вид   распределения   Гаусса:

 

 где Sm— площадь подвижной фазы в сечении колонки, u - скорость элюции, а, аt и tr — некие постоянные интегрирования.

    Физический смысл величины atпока раскрывать не будем, но отметим, что она имеет размерность времени. Символом tr в ходе решения уравнения обозначают следующую комбинацию исходных параметров:

 tr=L(1+K)/u            (9)

где К — коэффициент распределения вещества между фазами. Яспо, что при t << tr, как и при t >> tr, концентрация вещества у конца колонки равна нулю. При t = tr распределение Гаусса имеет мак­симум. Физически это означает, что к моменту времени t = tr мак­симум хроматографической зоны достигает конца колонки. Поэтому время tr мы вправе именовать «временем задержания вещества в ко­лонке» (retention time), или просто «временем элюции», или, как ранее, «временем удержания». Так как за это время зона проходит всю длину колонки L, то для скорости миграции  зоны  (v)  с  учетом  (9) можно записать   выражение:

 v=L/tr=u/(1+K)      (10)

Таким образом, мы приходим к важному заключению о том, что хроматографическая зона мигрирует вдоль колонки со скоростью, в (1 + К) раз меньшей, чем скорость элюции. Выше было показано качественно, что с увеличением К движение зоны замедляется, а на частных примерах даже обнаружилось, что оно замедляется в (1 + + К) раз по сравнению со скоростью движения фронта элюепта. Оказывается, что это соотношение можно получить строго для ре­альных условий хроматографии. Отношение скоростей миграции зоны и элюцпи обозначают символом R и называют фактором за­держки (чем меньше R, тем сильнее выражена задержка):

 

R= v/u= 1/(1 + К)    (11) 

В случае тонкослойной хроматографии это отношение скоростей, или, что то же самое, отношение расстояний миграции пятна ве­щества и фронта элюента, обозначают RF. Величина R будет тем меньше, чем больше К, т. е. чем больше сродство вещества к непо­движной фазе.
Запишем некоторые вытекающие из полученного заключения следствия.

    За время to, очевидно, из колонки выходит вся жидкость, которая исходно находилась между гранулами, т. е. свободный («мертвый») объем колонки Vo. Далее при неизменной скорости элюции и к моменту tr, когда хроматографическая зона достигнет конца колонки, из последней успеет выйти объем жидкости Vr, который можно назвать «объемом элюции» зоны. Из соотношения (2) следует, как описано ранее, что и объем элюции Vr будет в (1 + К) раз больше, чем свободный объем:

Vr= Vo(1 + К)         (12)

С учетом выражения (11) можно записать

Vr= Vо/R                 (13)

    Распределение (8), полученное при решении уравнения движения зоны, описывает ее форму как изменение концентрации вещества на конце колонки во времени. Нагляднее заменить его распределением по длине. Зона движется как целое со скоростью v. Для перехода в уравнении (8) от времен к расстояниям можно воспользоваться следующими соотношениями: tr = L/v, x= t*v. Аналогично вместо параметра at можно ввести параметр а через соотношение at= a/v. Стандартное отклонение а будет точно так же описывать хроматографическую зону, как и at, но уже в единицах длины, т. е. позволит охарактеризовать профиль зоны по длине колонки у самого ее конца. Теперь уравнение (8) с учетом (11) можно записать так:

 
 
      Именно этот вид уравнения позволяет раскрыть значение а через отдельные компоненты дисперсии, фигурирующие в сумме (3). В принятых выше обозначениях при решении общего дифферен­циального уравнения получаются (это нам придется принять на веру) следующие выражения для слагаемых суммарной дисперсии хроматографической зоны: а12= лdL (неоднородность тока жидкости в подвижной фазе); а22 = ymDmL/u (продольная диффузия в подвиж­ной фазе); а32 = ysDsL(1 — R)/Ru (продольная диффузия в неподвиж­ной фазе); а42 = R (1 — R) Lu/x. (неравновесность на сорбирующей поверхности); а52= wd2Lu/Dm (неравновесность в жидкости подвиж­ной фазы); a62 = ed2Lu/Ds (неравновесность в жидкости неподвижной фазы). Здесь л, ym, ys, w, е — постоянные коэффициенты, d — средний диаметр гранул сорбента, Dm— коэффициент диффузии моле­кул вещества в подвижной фазе, Ds— то же, в неподвижной фазе, х — константа   скорости   реакции   десорбции. Каждая отдельная дисперсия вносит свой вклад в суммарную дисперсию, т. е. в расширение хроматографической зоны. Приведен­ные выражения позволяют понять характер влияния выбора пара­метров хроматографического процесса на ширину зоны, т. е. содер­жат в себе очень важную практическую информацию. Например, легко видеть, что с увеличением диаметра гранул зона расширяется как за счет неоднородности тока жидкости, так и особенно за счет неравновесности распределения молекул вещества по объемам по­движной и неподвижной фаз. Эта неравновесность будет сказываться тем меньше, чем больше значения коэффициентов диффузии Dm и Ds, т. е. чем легче диффундирует вещество. С другой стороны облегчение диффузии (увеличение Dm и Ds) влечет за собой расши­рение зоны за счет продольной диффузии (особенно в подвижной фазе). Скорость элюции (u) также влияет двояким образом. С ее уве­личением вклад продольной диффузии в расширение зоны умень­шается, зато сильнее сказываются все неравновесности распределе­ния. Наконец, все факторы без исключения увеличивают дисперсию зоны пропорционально длине колонки L. Отсюда следует, что дви­жение хроматографической зоны вдоль колонки в неидеальных условиях связано с непрерывным расширением зоны. Это должно нас насторожить в отношении целесообразности увеличения длины колонки.

     Необходимо также отметить следующее: поскольку стандарт­ные отклонения суммируются как дисперсии, т. е. в виде квадратов то наибольшее из влияний будет резко доминировать над всеми остальными. Действительно, если, например, одно из отклонений равно 6 см, а второе — 2, то суммарное стандартное отклонение a составит (36 + 4)1/2, т. е. около 6,3 см. Это — очень существенное замечание. Из него следует, что усилия по улучшению характерис­тик колонки должны быть направлены целиком на доминирующий фактор. Очень часто в качестве такового выступает неравномерность тока подвижной фазы, обусловленная разбросом размеров гранул и несовершенством набивки колонки. Особенно неблагоприятная ситуация может складываться у стенок колонки, поэтому ее диаметр должен быть по меньшей мере в 50 раз больше среднего диаметра гранул.

    Очевидно, что должен существовать какой-то оптимум скорости элюции, при котором обеспечивается минимальное расширение зоны. Действительно, построение графика зависимости а2=f(u) дает всегда кривую с минимумом (рис. 6), которому и отвечает оптималь­ная скорость элюции. Практически ее не рассчитывают, а подбирают экспериментально по минимальному расширению хроматографи­ческого пика. Но это не делает наше теоретическое рассмотрение излишним. Оно показывает характер зависимости расширения зоны от скорости элюции. Из рис. 6 легко видеть, что для скоростей, не превышающих оптимальную, дисперсия очень резко (по гиперболическому закону) идет вверх — зона сильно расплывается за счет продольной диффузии. В отличие от этого при скоростях, боль­ших оптимальной, рост дисперсии зоны идет умеренно (по линей­ному закону).

Рис. 6  Зависимость дисперсии зоны от скорости элюции.
   
    Поэтому нередко имеет смысл использовать скорость элюции, в 5—6 раз большую оптимальной, и ценой незначительного расширения зон существенно уменьшить продолжительность опыта, но нельзя допускать, чтобы скорость элюции была намного ниже оптимальной. Это важный практический вывод. Можно показать, что оптимальная скорость элюции оказывается тем больше, чем выше значения коэффициентов диффузии вещества и чем меньше диаметр гранул. Уменьшение диаметра гранул снижает дисперсию зоны, улучшает разрешение пиков (см. ниже), позволяет повысить скорость и сократить время хроматографирования. Однако при этом растет гидравлическое сопротивление колонки, возникает необходимость вести элюцию при повышенном давлении и встают связанные с этим проблемы сжимаемости неподвижной фазы. Подробнее эти вопросы будут рассмотрены ниже; их успешное разрешение привело к бур­ному развитию за последние годы высокоэффективной хроматогра­фии при повышенном давлении.
    Отметим еще, что симметричная гауссова форма хроматографического пика реализуется только в том случае, когда поперечная диффузия и процессы сорбции—десорбции на сорбирующей поверх­ности более или менее успевают обеспечивать равновесное распре­деление вещества между фазами в ходе миграции зоны. Если этого не происходит, например при чересчур быстрой элюции, то форма пика искажается: его передний фронт оказывается крутым, а задний растягивается. Такая картина, нередко наблюдаемая на практике, может приводить к загрязнению последующего пика материалом, выходящим на «хвосте» предыдущего. Наше рассмотрение не толь­ко объясняет причину этого явления, но и указывает способ его устранения — снижение скорости элюции. Уменьшение диаметра гранул, облегчая установление равновесия, также препятствует развитию такого рода дисторсии.
    В современной жидкостной хроматографии при использовании гранул с малым разбросом диаметров и хорошей набивке колонок наибольший вклад в расширение зоны и ухудшение разрешения зачастую вносит неравновесность обмена на сорбирующей поверх­ности. Среди компонентов дисперсии в этом случае преобладает слагаемое а42, которое с учетом (11) можно представить так: а42 = К/(1+K)2*Lu/x. Отсюда следует, что   эта   дисперсия имеет максимум при равномерном распределении (К =1) и снижается по мере того, как распределение сдвигается в сторону неподвижной фазы (К>>1). Однако параллельно увеличивается вклад в дисперсию продольной диффузии в неподвижной фазе, поскольку, как легко видеть, вели­чина a32 растет с увеличением К (уменьшением R). Кроме того, как явствует из выражения (10), существенно замедляется скорость ми­грации. На практике стараются выбрать условия хроматографии так, чтобы значение К не превышало 40—50.
    В проведенном теоретическом рассмотрении было сделано пред­положение, что исходная зона имеет очень малую (точнее, бесконеч­но малую) ширину. На самом деле это не так: начальная зона имеет форму прямоугольника, который, очевидно, не может скачком пре­вратиться в колоколообразную кривую распределения Гаусса. Вначале расширение зоны идет за счет размывания ее переднего и заднего фронтов (рис. 7).

    Рис. 7 Последовательные этапы деформации хроматографической зоны конеч­ной ширины в ходе ее миграции по колонке (схема).
   
    Можно доказать, что профиль каждого фронта может быть описан соответствующей половиной кривой Гаусса. Практически в большинстве случаев аналитического фрак­ционирования хроматографические пики за время прохождения по колонке, расплываясь, успевают принять колоколообразную форму распределения Гаусса, поэтому сделанные выше качественные вы­воды относительно выбора скорости элюции и диаметра гранул со­храняют свою силу и для реального хроматографического процесса.
 

Концепция теоретических тарелок

    Введение понятия «теоретическая тарелка» базируется на том факте, что все шесть слагаемых суммарной дисперсии а2 содержат в качестве множителей длину колонки L. Это позволяет записать для дисперсии простое выражение: а2 = LH, или а = (LН)1/2 , где
    Из формулы (15) следует, что ширина зоны пропорциональна квад­ратному   корню из длины пути миграции зоны вдоль колонки.
    Величина Н характеризует качество колонки (в любом ее сече­нии) в отношении дисперсии хроматографической зоны в данных условиях эксперимента. Так как стандартное отклонение а здесь имеет размерность длины, тоиЯ должно иметь ту же размерность. Чем меньше величина Н, тем лучше работает колонка. В современных колонках добиваются того, что Н = (1 - 2) d, т. е. величине H отвечает размер порядка малых долей миллиметра. Отсюда появи­лось наглядное представление о тонком диске, как бы вырезанном из колонки. Его образно назвали «теоретической тарелкой», а ве­личину Н именуют «высотой теоретической тарелки». Исторически этот термин появился при рассмотрении модели хроматографиче­ского процесса, где непрерывную элюцию заменяли малыми скач­кообразными продвижениями зоны, подобно тому как это было сде­лано выше в методе диаграмм. Кстати, с помощью этого метода понятию теоретической тарелки можно придать наглядный смысл. Как было установлено, с умень­шением ширины гипотетического скачка, описывающего продвиже­ние зоны вдоль колонки, меняется и форма зоны, в частности сте­пень ее расширения. Представим себе, что при хроматографировании определенного вещества в реальных условиях мы эксперимен­тальным путем нашли закон расширения зоны, а затем подобрали ширину теоретического скачка так, чтобы расширение, описываемое методом диаграмм, следовало бы точно такому же закону. Ширина этого скачка и отвечает понятию высоты теоретической тарелки Н. В методе диаграмм мы не принимали во внимание продольной диффузии, однако можно себе представить, что существует более сложная модель скачкообразного движения зоны, учитывающая все факторы, ведущие к размыванию зоны. Ширина эквивалент­ного скачка в этой модели может служить наглядной иллюстрацией понятия о величине Н. Впрочем, всегда лучше остерегаться наглядных аналогий и не упускать из виду реальный смысл тех или иных понятий. Лучше считать, что высота теоретической тарелки Н — это просто пара­метр хроматографического процесса, учитывающий совокупность ряда физических факторов, размывающих зону, а его размерность совпадает с размерностью   длины. Следует подчеркнуть, что высота теоретической тарелки харак­теризует отнюдь не только саму колонку. Из параметров собственно колонки на величину Н явным образом влияет диаметр гранул (d), а неявным — коэффициент л, значение которого сильно зависит от степени однородности набивки колонки. Однако, кроме этих пара­метров, высоту Н определяют и выбор скорости элюции (u), и харак­тер диффузии вещества в обеих фазах (Dm, Ds),и распределение ве­щества между зонами (R), и кинетика сорбции (х). Таким образом, для разных препаратов или при разных условиях элюции одна и та же колонка может характеризоваться различными значениями Н. Нередко для характеристики качества хроматографического процесса пользуются термином «число теоретических тарелок» (N), под которым подразумевают отношение длины колонки к вы­соте тарелки:

N = L/Н             (16)

    Ниже будет показано, что это отношение определяет разрешающуюспособность данного хроматографического процесса —именно про­цесса, а не только самой колонки. Подчеркиваем это еще раз, для того чтобы читатель критически относился к рекламным данным многих фирм, утверждающих, что выпускаемые ими колонки имеют столько-то тысяч теоретических тарелок, не указывая при этом, для каких веществ и в каких условиях элюции подсчитаны эти тысячи. Число теоретических тарелок легко оценить по результатам хроматографического эксперимента. Подставив в (16) выражение для а = (LН)1/2, можно записать:
 
    Вместо полуширины а удобнее использовать полную ширину пика у его основания (W). Выше было отмечено, что для распределения Гаусса W ≈4а, тогда:

N = 16(L/W)2   (18)

    Выше мы обозначили скорость движения хродттографической зоны по колонке символом v. Очевидно, что продолжительность выхода пика вещества из ко­лонки tp =W/v. За это время элюент вытекает из колонки со ско­ростью и. Отсюда следует, что VP = Wu/v. Продолжительность миграции хроматографической зоны вдоль длины колонки tL =L/v, а объем элюции  Vr= Lu/v. Теперь можно подставить в (18) выражения L = Vrv/u и W = Vpv/u и получить практически удоб­ную формулу для определения числа теоретических тарелок:

N = 16(Vr/Vp)2 (19)

    Иногда в целях получения более концентрированного раствора очищенного вещества предпочитают отобрать не весь пик, а ту (основную) его часть, которая лежит между ординатами, соответст­вующими половине высоты пика. Если объем этой части обозначить F0,5, то выражение (19) с учетом формы распределения Гаусса изме­нится на аналогичное, но с другим коэффициентом:

N = 5,54(Vr/V0.5)2         (20)

    Вместо объемов в формулы (19) и (20) можно подставить соот­ветствующие времена: время задержания зоны на колонке и про­должительности выхода всего пика или основной его части. Остается добавить, что все эти измерения и расчеты будут более или менее корректными, если объем исходной зоны мал по сравнению с  объемом выходящего пика (практически этот объем обусловлен именно неидеальностью хроматографического процесса). Так будет в том случае, когда количество исходного материала невелико и он хо­рошо сорбируется  в верхней части колонки.
 

 Разрешение близко мигрирующих зон

    Уже отмечалось ранее:"Процессы удерживания и размывания - предмет теории хроматографии." Целью же хроматографического эксперимента, в аналитическом его варианте, является разделение («разрешение») в ходе миграции вдоль колонки или пластинки хроматографическнх зон, содержа­щих чистые компоненты фракционируемой смеси веществ. Эти зоны или (в случае широких зон) их передний и задний фронты имеют форму кривых распределения Гаусса. Естественно задать вопрос: при каком минимальном расстоянии между зонами разрешение можно    считать   удовлетворительным?

Обозначим Ãх расстояние между максимумами двух соседних зон, описываемых распределением Гаусса (рис. 9). Разрешением (Rs) двух  таких  зон   называют следующее  отношение:

 
     Или, принимая во внимание, что ширина пика у основания w приближенно равна как раз 4а, то можно выразить Rs следующим образом:
 
    Так как ширина кривой Гаусса у основания приближенно равна как раз 4а, то полуширина зоны (или ширина фронта широкой зоны у ее основания) равна 2а. Для двух соседних зон величину стандарт­ного отклонения а можно считать одинаковой, поэтому минимальное значение разрешения, при котором зоны можно физически разде­лить, равно единице (Rs= 1). Можно показать, что при этом вза­имное загрязнение зон (одинаковой амплитуды) за счет «хвостов» кривых Гаусса составляет примерно 2,3%.

Рис. 8  Расстояние между узкими хроматографическими  зонами, мигрирую­щими по  колонке  (слева направо).

 

Найдем зависимость разрешения от параметров хроматографи­ческого процесса. На рис. 8 показаны две соседние зоны, макси­мумы которых в некий момент времени t (считая от начала элюции) мигрировали на расстоянии х1 и х2. Если скорости их миграции обозначить v1 и v2, а факторы задержки (см. формулу 11) — соответ­ственноR1и R2 очевидно, что Ãх = х2 — хг =v2t-v1t= ut (R2— R1) = utÃR. В среднем для двух близких зон можно считать, что ut= vt/R= x/R. Тут и далее R=(R1+R2)/2. Таким образом, Ãх = xÃR/R. К концу колонки (х = L) расхождение зон достигает максимума:
  
Таким образом, расхождение максимумов зон к концу миграций пропорционально длине колонки, степени различия в сродстве двух веществ к неподвижной фазе (ÃR), и тем больше, чем меньше R. т. е. чем сильнее само это сродство. Формулу (21) для разрешения с учетом а = (LН)1/2 теперь можно записать так:
  

  Отсюда следует, что разрешение близких зон пропорционально квадратному корню из длины колонки. Этого следовало ожидать, поскольку одновременно с расхождением максимумов зон (пропор­ционально L) происходит их расширение (пропорционально L1/2). Таким образом, если мы хотим вдвое улучшить разрешение сосед­них зон, придется увеличить длину колонки в четыре раза.

Из формулы (23) следует, что улучшать разрешение эффективнее не за счет длины колонки, а за счет выбора хроматографической системы, обеспечивающей более выраженное различие сродства двух веществ к неподвижной фазе. Следует подчеркнуть, что если хроматографическая система разделения близких зон отработана на ма­лой колонке, то при переносе ее на колонку большего размера сле­дует увеличивать объем только за счет ее диаметра, оставив подоб­ранную длину колонки неизменной. Скорость элюции (мл/ч) следует повысить пропорционально увеличению площади сечения колонки, с тем чтобы линейная скорость течения подвижной фазы (или, что то же самое, расход элюонта в расчете на 1 см2 площади сечения ко­лонки) оставалась неизменной.
Выражение (23) можно записать, используя N — число теорети­ческих тарелок: Rs= 1/4N1/2ÃR/R. Отсюда видно, каким образом число теоретических тарелок характеризует разрешающую способ­ность   хродгатографического   процесса.
До сих пор мы считали зону чисто гауссовой, молчаливо пренеб­регая протяженностью исходной зоны и как следствие возможностью наличия «площадки» на профиле мигрирующей зоны (рис. 9).
 
 
Рис. 9. Расстояние между широкими хроматографическимии зонами с «пло­щадкой»

    Ширина переднего и заднего фронтов зоны у ее основания равна 2а, и если к концу колонки близкие соседние зоны еще сохранят пло­щадку шириной эпсилон, то минимальное расстояние между зонами, отве­чающее их разрешению, будет составлять Ãх = 4а + эпсилон. В препа­ративных вариантах хроматографии бывает, что эпсилон >> а. В таких слу­чаях расширение фронтов зон можно не учитывать, а условие раз­решения записать проще:Ах>=эпсилон. Разрешение в этом случае лучше представить себе как R'=Ах/эпсилон. Оно пропорционально длине колон­ки (за счет Ах), а не корню из ее длины.

    Для характеризации разрешения в литературе приводят еще одну сравнительную термодинамическую характеристику двух разделяемых пиков ве­ществ - относительное удерживание

   или селективность. Эта величина показывает способность данной хроматографической сис­темы разделять данную пару веществ x и y.
 
    Времена удерживания и все производные от них величины являются по существу термодинамическими характеристиками процесса. Однако, в хроматографии (как в любом химическом процессе) результат определяется совместным влиянием факторов термодина­мического и кинетического типа. Если в хроматографической системе данного состава при данной температуре у двух веществ значения tR одинаковы (или α=1.0), то никакое измене­ние геометрии колонки не приведет к разделению этой пары. Но, с другой стороны, различие значений tR вовсе не означает автоматически, что разделение, а тем более хорошее, будет достигнуто. Для этого используемая колонка должна обладать достаточно высокими кинети­ческими характеристиками. Акты сорбции-десорбции должны совершаться с большой ско­ростью, чтобы реализовать потенциальную возможность разделения, на которую указывает различие в tR.
 
    Совместное влияние селективности, удерживания и эффективности на результат раз­деления можно проиллюстрировать наглядно (рис. 10).

 

 
Рис. 10. Совместное влияние селективности, удерживания и эффективности на результат раз­деления.

Классификация хроматографических методов

Всем хроматографическим методам присущи некоторые общие характеристики, позволяющие изложить элементы их обобщенной теории. Однако необходимо рассмотреть специфические особенности различных вариантов хроматографического фракционирования. Это, с одной стороны, позволит за теоретическими рассуждениями все время видеть реальные черты хроматографического эксперимента, а с другой — даст возможность ввести классификацию хроматографических методов. Существует несколько  классификаций методов хроматографии: по принципу фракционирования; по способу элюции и т.д. (см. рисунок). На сайте приведены теоретические и практические основы самых распространенных видов классификаций. Более подробно основные виды классификации рассмотрены в соответствующих подразделах нашего сайта. 

Классификация

 

 


 

Классификация по агрегатному составу фаз

Как ясно следует из названия данная классификация основана на различиях в агрегатных состояниях применяемых в хроматографии подвижных и неподвижных фаз.  В данной классификации (см. рисунок) все виды подразделяются на 3 основных вида по агрегатному состоянию используемой подвижной фазы: газовая (ГХ, GH), жикостная (ЖХ, LH) и  сверхкритическая флюидная хроматография (подвижная фаза - полярный газ (СО2, NH3 и т.д.) сжатый до жидкого состояния) - что совершенно естественно, т.к. именно подвижная фаза растворяя в себе пробу  определяет спектр разделяемых и анализируемых веществ. Совершенно логичным следующим уорвнем классификации является классификация по агрегатному состоянию используемой неподвижной фазы, отвечающей за взаимодействие и разделение веществ.

Газовая хроматография

 

Газовая хроматография (ГХ) - хроматография, в которой подвижная фаза находится в состоянии газа или пара - инертный газ (газ-носитель).  Неподвижной  фазой  является  высокомолекулярная  жидкость, закрепленная на пористый носитель или на стенки длинной капиллярной трубки, или только твердое пористое вещество, заполняющее колонку , в следствии чего газовая хроматография подразделяется на газо-жидкостную и газо-твердофазную. Газовая  хроматография - универсальный  метод  разделения  смесей  разнообразных  веществ,  испаряющихся  без  разложения.  При  этом компоненты  разделяемой  смеси  перемещаются  по  хроматографической колонке  с  потоком  газа-носителя. По мере  движения  разделяемая  смесь многократно распределяется между  газом-носителем (подвижной фазой) и неподвижной фазой. Принцип разделения - неодинаковое сродство веществ к летучей подвижной фазе и стационарной фазе в колонке. Компоненты смеси селективно задерживаются последней,  поскольку  сродство их  к  этой  фазе  различно,  и  таким образом разделяются (компонентам с большим сродством требуется большее время для выхода из неподвижной фазы, чем компонентам с меньшим сродством). Затем вещества выходят из колонки и регистрируются детектором. Сигнал детектора записывается в виде хроматограммы автоматическим  потенциометром (самописцем)  или же  регистрируется  компьютером.

Области применения газовой хроматографии

Метод ГХ — один из самых современных методов многокомпонентного анализа, его отличительные черты — экспрессность, высокая точность, чувствительность, автоматизация. Метод позволяет решить многие аналитические проблемы. Количественный ГХ анализ можно рассматривать как самостоятельный аналитический метод, более эффективный при разделении веществ, относящихся к одному и тому же классу (углеводороды, органические кислоты, спирты и т.д.).

Рис. Пример разделения смеси газов с использованием ГХ.

Этот метод незаменим в нефтехимии (бензины содержат сотни соединений, а керосины и масла —тысячи), его используют при определении пестицидов, удобрений, лекарственных препаратов, витаминов, наркотиков и др. При анализе сложных многокомпонентных смесей успешно применяют метод капиллярной хроматографии, поскольку число теоретических тарелок для 100 м колонки достигает (2—3)*105. Возможности метода ГХ существенно расширяются при использовании реакционной газовой хроматографии (РГХ), вследствие того что многие нелетучие, термонеустойчивые или агрессивные вещества непосредственно перед введением в хроматографическую колонку могут быть переведены с помощью химических реакций в другие — более летучие и устойчивые. Химические превращения осуществляют чаще на входе в хроматографическую колонку, иногда в самой колонке или на выходе из нее перед детектором. Значительно удобнее проводить превращения вне хроматографа. Недостатки метода РГХ связаны с появлением новых источников ошибок и возрастанием времени анализа. Реакционную хроматографию часто используют при определении содержания микроколичеств воды. Вода реагирует с гидридами металлов, с карбидом кальция или металлическим натрием и др., продукты реакции (водород, ацетилен) детектируются с высокой чувствительностью пламенно-ионизационным детектором. К парам воды этот детектор малочувствителен. Широко применяют химические превращения в анализе термически неустойчивых биологических смесей. Обычно анализируют производные аминокислот, жирных кислот С10—C20, сахаров, стероидов. Для изучения высокомолекулярных соединений (олигомеры, полимеры, каучуки. смолы и т.д.) по продуктам их разложения используют пиролизную хроматографию. В этом методе испарение пробы заменяют пиролизом.Карбонаты металлов можно проанализировать по выделяющемуся диоксиду углерода при обработке их кислотами.Методом газовой хроматографии можно определять металлы, переводя их в летучие хелаты. Особенно пригодны для хроматографирования хелаты 2-, 3- и 4-валентных металлов с b-дикетонами. Лучшие хроматографические свойства проявляют b-дикетонаты Be(II), Al(III), Sc(III), V(III), Cr(III). Газовая хроматография хелатов может конкурировать с другими инструментальными методами анализа. ГХ используют также в препаративных целях для очистки химических препаратов, выделения индивидуальных веществ из смесей. Метод широко применяют в физико-химических исследованиях: для определения свойств адсорбентов, термодинамических характеристик адсорбции и теплот адсорбции, величин поверхности твердых тел, а также констант равновесия, коэффициентов активности и др. При помощи газового хроматографа, установленного на космической станции "Венера-12", был определен состав атмосферы Венеры. Газовые хроматографы устанавливают в жилых отсеках космических кораблей: организм человека выделяет много вредных веществ, и их накопление может привести к большим неприятностям. При превышении допустимых норм вредных веществ автоматическая система хроматографа дает команду прибору, который очищает воздух.

 

Practical Faster GC Applications with Capillary GC Columns - Agilent

Жидкостная хроматография

Жидкостная хроматография (ЖХ) - способ (метод) хроматографического разделения в котором подвижной фазой является жидкость и разделяемые вещества находятся в постоянном равновесии между подвижной и неподвижной фазой. По типу неподвижной фазы различают: жидкостно-жидкостную, жидкостную-твердофазную и жидкостно-гелевую хроматографии (см. Рис Классификация по агрегатному составу фаз).

Сфер применения ЖХ почти так же много, как велико количество направлений человеческой деятельности, где необходимо изучить состав различных растворов или выделить какое-либо вещество из жидкости. Практически не заменима ЖХ при определении и фракционировании высокомолекулярных лабильных соединений биологического происхождения: нуклеиновых кислот и белков. По началу основным недостатком метода, по сравнению с ГХ, была его низкая разрешающая способность , обусловленная несколькими причинами: высокой вязкостью подвижных фаз, и, следовательно, низкой скоростью диффузии; неоднородностью подвижных фаз; ограничения в длине колонки и т.д. Но значительный прогресс в производстве высокоточных приборов (в первую очередь насосов), сорбентов и вычислительной техники привел к появлению метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сравнимого по числу теоретических тарелок с газовой хроматографией (N ~ 100000). Основным отличием ВЭЖХ от классической колоночной ЖХ является использование мелкодисперсных (<10 mkm) сорбентов на основе жестких матриц (зачастую из силикагеля) и высоких скоростей потока.

 

Сверхкритическая флюидная хроматография

 
Сверхкритическим флюидом (СКФ) — называют состояние вещества, при котором исчезает различие между жидкой и газовой фазой. Любое вещество, находящееся при температуре и давлении выше критической точки является сверхкритическим флюидом. Свойства вещества в сверхкритическом состоянии промежуточные между его свойствами в газовой и жидкой фазе. Так, СКФ обладает высокой плотностью, близкой к жидкости, и низкой вязкостью, как и газы. Коэффициент диффузии при этом имеет промежуточное между жидкостью и газом значение. Вещества в сверхкритическом состоянии могут применяться в качестве заменителей органических растворителей в лабораторных и промышленных процессах. Наибольший интерес и распространение в связи с определенными свойствами получили сверхкритическая вода и сверхкритический диоксид углерода (Рисунок 1).
 
Рис. 1. Фазовая диагармма двуокиси углерода.
 
Сверхкритическая флюидная хроматография имеет ряд преимуществ переджидкостной хроматографией и газовой хроматографиейВ ней возможно применение универсальных ПИД-детекторов (в отличие от ЖХ), разделение термически нестабильных веществ и нелетучих веществ (в отличие от ГХ). На данный момент, несмотря на все преимущества, не нашла широкого применения (за исключением некоторых особых областей, таких как разделение энантиомеров и высокомолекулярных углеводородов). Несмотря на высокую чистоту получаемых соединений, высокая стоимость оборудования делает современного СКФ хроматографию применимой только в случае очистки или выделения догорих веществ. Очень перспективна и активно внедряется СКФ хроматография, например, в медицине.
 
В Таблице 1 приведены критические параметры и молярная масса для практически наиболее применимых веществ.
 

Таблица 1. Критические параметры различных растворителей (Reid et al, 1987).

 

Растворитель

Молекулярная масса

Критическая температура, Tкрит

Критическое давление, Pкрит

Критическая плотность, ρкрит

 

г/моль

K

МПа (атм.)

г/см3

 

Диоксид углерода (CO2)

44.01

303.9

7.38 (72.8)

0.468

 

Вода (H2O)

18.015

647.096

22.064 (217.755)

0.322

 

Метан (CH4)

16.04

190.4

4.60 (45.4)

0.162

 

Этан (C2H6)

30.07

305.3

4.87 (48.1)

0.203

 

Пропан (C3H8)

44.09

369.8

4.25 (41.9)

0.217

 

Этилен (C2H4)

28.05

282.4

5.04 (49.7)

0.215

 

Пропилен (C3H6)

42.08

364.9

4.60 (45.4)

0.232

 

Метанол (CH3OH)

32.04

512.6

8.09 (79.8)

0.272

 

Этанол (C2H5OH)

46.07

513.9

6.14 (60.6)

0.276

 

Ацетон (C3H6O)

58.08

508.1

4.70 (46.4)

0.278

 

Аммиак (NH3)

17.03

405.3

11.35 (115.7)

0.322

 

Ксенон (Xe)

131.29

289.5

5.84 (58.4)

1.110

 

 

Одно из наиболее важных свойств сверхкритического состояния - это способность к растворению веществ. Изменяя температуру или давления флюида можно менять его свойства в широком диапазоне. Так, можно получить флюид, по свойствам близкий либо к жидкости, либо к газу. Так, растворяющая способность флюида увеличивается с увеличением плотности (при постоянной температуре). Поскольку плотность возрастает при увеличении давления, то меняя давление можно влиять на растворяющую способность флюида (при постоянной температуре). В случае с температурой завистимость свойств флюида несколько более сложная - при постоянной плотности растворяющая способность флюида также возрастает, однако вблизи критической точки незначительное увеличение температуры может привести к резкому падению плотности, и, соответственно, растворяющей способности [5]. Сверхкритические флюиды неограниченно смешиваются друг с другом, поэтому при достижении критической точки смеси система всегда будет однофазной. Приблизительная критическая температура бинарной смеси может быть рассчитана как среднее арифмитическое от критических параметров веществ
Tc(mix) = (мольная доля A) x TcA + (мольная доля B) x TcB.
Если необходима большая точность, то критические параметры могут быть рассчитаны с использованием уравнений состояния, например с помощью уравнения Пенга-Робинсона.
 
Уникальная способность сверхкритического флюида растворять большие объемы газа, в особенности H2 и N2, в купе с высоким коэффициентом диффузии, делает его использование в качестве растворителя химических реакцийего чрезвычайно перспективным. Изменение температуры и давления позволяют влиять на свойства растворителя и маршрут реакции, что делает возможным более высокие выходы целевого продукта. Также следует заметить что использование CO2 абсолютно экологично.


 

 

 

Классификация по принципу фракционирования

В любом хроматографическом процессе фигурируют неподвижная и подвижная фазы, между которыми рас­пределяются молекулы фракционируемой смоси веществ. Под основным принципом фракционирования буде.м подразумевать природу физического, химического или биологического явления, обусловливающего   такое   распределение.

Адсорбционная хроматография

В этом процессе неподвижная фаза представляет собой твердый сорбент. Равновесие процессов сорбции и десорбции в условиях, достаточно далеких от насыщения емкости сорбента, устанавливает­ся независимо для каждого компонента смеси веществ. Различие в коэффициентах адсорбции обусловливает разницу в распределении этих компонентов между сорбентом и подвижной жидкой фазой. Соответственно чем большим сродством к сорбенту обладает данный компонент смеси, тем медленнее он будет мигрировать вслед за элюен-том вдоль колонки или пластинки. Если сорбция происходит на наружной поверхности сплошных гранул, то имеет место адсорбцион­ная хроматография в чистом виде. Если же материал сорбента имеет пористую структуру и большая часть сорбирующей поверх­ности находится внутри его гранул, то в задержании молекул веще­ства в неподвижной фазе участвует еще и процесс их диффузии в неподвижной жидкости внутри пор, подобно тому как это имеет место при гель-фильтрации. Практически, впрочем, связывание вещества    за   счет   сорбции   доминирует.

Аффинная хроматография

Относительно слабое обратимое взаимодействие между молеку­лами биполимеров и сорбентом может осуществляться за счет сил биологического сродства. Такие силы действуют, например, между ферментом и его субстратом или ингибитором, антигеном и антите­лом, гормоном и рецептором и т. д. Для осуществления фракциони­рования по биологическому сродству, т. е. методом аффинной хро­матографии, один из «партнеров» такой пары химически закрепляют на матрице «биоаффинного» сорбента, а сорбцией и элюцией второго «партнера» управляют путем изменения условий биологического взаимодействия в результате введения в элюент солей, мочевины, детергентов, конкурирующих молекул или изменения его рН (см. рисунок).

 

В большинстве случаев имеет место не хроматографический процесс фракционирования   смеси веществ, а очистка одного из них путем избирательной сорбции, промывки и последующей десорбции. Впрочем, возможны варианты и истинной хроматографии, исполь­зующей явление аффинного взаимодействия. При этом фракциони­рованию подвергается смесь близко родственных биологических макромолекул, различающихся по своему сродству к одному тому же   аффинному   сорбенту.

Иногда явление биологического сродства используется только в процессе элюции. В этом случае вещество связывается с поверх­ностью твердого сорбента за счет ионного взаимодействия или сил адсорбции, а элюцию осуществляют путем увеличения его сродства к элюенту, куда вводят биологически родственные (в указанном выше смысле) молекулы. Такой процесс было бы точнее называть аффинной элюцией. Имеются примеры, когда один из партнеров аффинной пары имеет не биологическое происхождение, а представ­ляет собой, например, сложный краситель, пространственная конфи­гурация которого имитирует какую-либо биологическую структуру.

Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой из­бирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Не­редко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается лег­кой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице.

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугиро­вания и декантации.

Одной из разновидностью афинной хроматографии является металхелатная хроматография, основанная на образовании комплексов между нанесенным на сорбент ионом металла, например кадмия или никеля (никель-хелатная хроматография), и специфичеким линкером, обычно 6-10 остатков гистидина, химически связанным с целевым белком (Рис. 2). Особенно часто данный метод применяется при очистке генноинженерных белков, генетический код которых заклонирован в специально сконструированные плазмиды. В результате чего молекула белка экспрессируется с присоедененным полигистидиновым концом, за счет которого она специфичеки связывается ионом металла при нанесении на колонку, а примеси при этом не задерживаются, что позволяет достичь очень большой чистоты целевого продукта при минимальных затратах. Также, при необходимости возможно провести ренатурацию связанных с сорбентом белков (например обратным градиентом мочевины) после чего элюировать уже чистый биологически активный белок.

Рис. 2. Прикрепление белка с гистидиновой зацепкой к грануле в аффинной колонке. Около 10 гистидиновых остатков присоединены к белку с помощью генетической инженерии, например, сочетанием сайт-специфического мутагенеза с полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (см. Nolting, 1999b). Гистидиновые остатки прочно связываются с гранулами, сделанными из никель-хелатирующей смолы.

Также возможен несколько иной вариант аф­финной хроматографии, в котором неправильно свернутый белок с помощью шаперонов сворачивается правильным образом и элюируется буферным раствором (Рис. 3).

 

Рис. 3. Исправление свертывания дорогих, плохо сворачивающихся, белков: шапероны, называемые также шаперонинами, при­креплены к гранулам, и развернутый или неправильно свер­нутый белок пропускается сквозь колонку. Шаперон взаимо­действует с образцом белка и катализирует его сворачивание в правильной конформации.

Один из методов тестирования аффинных сорбентов приведен тут.

 

Гель-фильтрация

В этом простейшем варианте хроматографии молекулы фракционируемых веществ не должны обладать никаким специальным срод­ством к неподвижной или подвижной фазам. Неподвижная фаза здесь представлена жидкостью, находящейся внутри пористых гранул,— точно такой же, как п жидкость подвижной фазы, проте­кающей между ними. Благодаря силам сцепления с поверхностью пространственной сетки полимера или иного пористого материала, образующего гранулы, жидкость внутри них остается неподвижной и не увлекается течением подвижной фазы. В подавляющем боль­шинстве случаев применения гель-фильтрации для биологических целей рабочей жидкостью служат водно-солевые растворы, а матери­алы   гранул   гидрофильны.

 

Переход молекул вещества из подвижной фазы в неподвижную и обратно за счет диффузии ничем не затруднен. Иная ситуация складывается внутри гранул. Здесь диффузия более или менее за­труднена из-за столкновений молекул диффундирующего вещества с нитями пространственной сетки полимера или стенками пор. Если размеры молекул соизмеримы со средним диаметром каналов в гранулах, то эти затруднения становятся весьма существенными и диффузия тормозится. Может сложиться и такое положение, когда часть внутреннего объема гранул, т. е. часть объема неподвиж­ной фазы (а иногда и весь этот объем), оказывается недоступной для молекул вещества,  растворенного   в  подвижной фазе.

Различие степени доступности объема неподвижной фазы для молекул различных компонентов исходной смеси веществ является фактором, определяющим возможность их фракционирования. Оче­видно, что оно будет происходить по размерам молекул (Рис. 1). Если в со­ставе смеси имеются очень крупные молекулы, вовсе не проникаю­щие внутрь гранул, то они будут выходить из колонки или достигать края хроматографической пластины вместе с передним фронтом подвиж­ной фазы («фронтом элюции»). В то же время мелкие молекулы, свободно диффундирующие внутрь гранул, часть времени будут находиться в неподвижной фазе. Статистически эта часть времени одинакова для всех молекул такого размера и зависит от соотношения объемов жидкости в неподвижной и подвижной фазах. Таким образом, все мелкие молекулы достигнут конца хроматографического пути более или менее одновременно и заведомо позднее, чем крупные. Молекулы промежуточных размеров, для которых из-за разброса значений еффективных диаметров пор внутри гранул неподвижной фазы до­ступна только часть ее объема, должны, очевидно, перемещаться вдоль  колонки или пластины с промежуточной скоростью.

Рис. 1. Гель-фильтрационная хроматография. Малые молекулы в об­разце могут проникать внутрь гранул, вследствие этого они протекают через колонку медленнее. Крупные молекулы, ко­торые не могут проникнуть в гранулы через поры, проходят сквозь колонку быстрее, чем более мелкие. Правильный раз­мер пор и свойства растворителя являются решающими для хорошего разделения.

Это явление первоначально было названо «гель-фильтрацией», поскольку в качестве пространственной сетки использовали поли­мерные гели. Однако эти гели относительно легко деформируются и для хроматографии при высоком давлении непригодны, поэтому их стали заменять жесткими материалами, в частности пористым стеклом и силикагелем. Иногда для этого варианта хроматографии вводят термин «эксклюзивная хроматография» («exclusion» — исклю­чение; имеется в виду исключение из гранул крупных молекул). Поскольку сейчас силикагель явно вытесняет пористое стекло, мы сохраним для рассматриваемого варианта хроматографии прежнее название — гель-фильтрация.

Очевидно, что размеры молекул связаны с их массами, но отнюдь не целиком ими определяются. Это особенно важно учитывать в случае макромолекул, размеры которых могут существенно зави­сеть от плотности упаковки полипептидной или полинуклеотидной цепи. В ограничении свободы диффузии через пространственную сетку пор внутри гранул немалую роль может играть и форма моле­кулы. Очевидно, что сферическая глобула будет диффундировать иначе, чем молекула такого же объема, но вытянутая в виде палочки.

Как во всех хроматографических разделениях излишняя длина колонки приводит к размыванию пика (Рис. 2).

Рис. 2. Уширение полос в колон­ке из-за чрезмерной длины колон­ки. Так называемая эффективная часть колонки является достаточной для разделения. Слишком длинные колонки не улучшают очистку, но вызывают разбавление образца из-за уширения полос.

 

Гель-фильтрационная хроматография является также вспомогатель­ным методом для оценки молекулярной массы молекул (рис. 2.11). Несмотря на то, что для этого существуют гораздо более точные мето­ды, например, масс-спектрометрия, гель-фильтрация ока­зывается полезной для измерения равновесий мономер-мультимер при микромолярных (мкМ) концентрациях биомолекул (Рис. 3).


  Рис.3. Молекулы с известной молекулярной массой дают возмож­ность оценить молекулярную массу неизвестной молекулы. В данном случае для исследуемой молекулы наблюдаются два пика, что указывает на равновесие мономер-димер.

Пористые материалы для гель-фильтрации чаще всего выпускают­ся в виде сферических гранул целого набора диаметров с различными средними размерами пор.

Ионообменная хроматография

Этот процесс сходен с адсорбционной хроматографией в следствии того, что задержание молекул вещества в неподвижной фазе обусловлено их связыванием с поверхностью твердого гидрофильного материала сплошных или пористых гранул, находящихся в контакте с жидким элюентом. Однако в этом варианте хроматографии задержание происходит не за счет молекулярной адсорбции, а в результате электростатиче­ского   взаимодействия   разноименно   заряженных   ионов.

На всех   наружных и внутренних поверхностях твердых гранул  вдоль нитей полимеров и гелей, образующих пространственную сетку, более или менее равномерно распределены ковалентно связан­ные с этими поверхностями ионогенные группы. В омывающем их водном элюенте они диссоциируют, образуя сетку одноименно заря­женных неподвижных ионов. Если молекулы компонентов фракци­онируемой смеси тоже способны ионизироваться при растворении, причем так, что их суммарный заряд имеет противоположный знак, то они связываются с неподвижными ионогенными группами силами электростатического взаимодействия, оказываясь тем самым фиксированными в неподвижной фазе. Связь эта обратима: ионы одних компонентов могут замещаться на другие или вытесняться находящимися в элюенте контрионами ионогенных групп сорбента, а также специально вводимыми для этой цели в элюент ионами. Происходит обмен ионов, поэтому сорбенты описанного типа называ­ют  ионообменниками (ионитами).

Выбор ионообменного сорбента  для очистки белка в зна­чительной степени зависит от изоэлектрической точки белка — pi. При значениях рН, превышающих pi белка, его молекулы приобретают в целом отрицательный заряд и способны адсорбироваться анионным обменником. При рН ниже pi белок будет адсорбироваться катион-ным обменником. Например, если pi = 4, то в большинстве случаев целесообразно подобрать сорбент, который способен связывать белок при рН > 4. Поскольку при рН > 4 такой белок заряжен отрицательно, то сорбент должен быть анионообменником, например, с диэтиламиноэтильной функциональной группой (ДЭАЭ). Можно было бы использовать рН < 4 и катионообменник, но многие белки в таких условиях нестабильны, либо образуют агрегаты. Если, напротив, белок, который мы хотим очистить, имеет pi = 10, то он будет заряжен поло­жительно в условиях, пригодных, как правило, для ионообменной хро­матографии, т. е. при рН около 7. Таким образом, в общем, для белка такого типа мы должны выбрать катионообменный сорбент, например, с карбоксиметильной функциональной группой (КМ), которая при нейтральном рН заряжена отрицательно.

 
 
Адсорбирующая способность сорбента сильно зависит от рН и от pi разделяемых белков (рис. 1), но также от качества сорбента, прилагаемого давления и от числа прогонов колонки. Чтобы увеличить срок службы сорбента, его следует тщательно промыть, хранить в подходящем растворителе и не применять рН и давле­ние вне предписанных допустимых пределов.

Рис. 1. Зарядовые свойства анионо- и катионообменников. Анионообменник с ДЭАЭ имеет значительную емкость при низких и средних значениях рН=1-6; катионообменник с КМ имеет высокую емкость при высоких и средних значениях рН=6-14.
 
На представленном рисунке показаны профили сил удерживания т.н. "слабых" ионообменников, емкость которых значительно зависит от рН подвижной фазы. Также широко распространены "сильные" катионообменники, практически не меняющие  свою емкость в широком диапазоне рН. В этих ионитах в качестве ионогенных групп используются или остатки сильных кислот (например, серной) в катионообменниках, или  сильные основания (например, четвертичные амины) в анионообменниках. В первом случае катионообменник имеет рабочий интервал рН равен 1-14, а во втором случае - 1-11. На практике при выборе силы обменника следует учитывать множество факторов, например крупные белковые молекулы могут в неподходящих условиях необратимо связываться с "сильными" анионитами.
Разрешающая способность хроматографического разделения зависит преимущественно от типа биомолекул, типа и качества сорбента, ионной силы градиента при элюции, от температуры и от геометрии колонки.
Как уже отмечалось, возможность фракционирования компонентов смеси веществ обусловлена здесь различием в значениях их суммарных зарядов. Последние зависят как от числа и характера ионогенных групп в молекулах, так и от полноты их диссоциации, которую можно контролировать путем выбора рН и ионной силы элюента. Чем боль­ше в данных условиях элюции суммарный заряд того или иного компонента смеси, тем сильнее его взаимодействие с ионообменником и тем медленнее он мигрирует вдоль колонки. Так, на рисунке 2 представлен пример разделения аминокислот, имеющих разный заряд.
 
Рис.2 Разделение имеющих разный заряд аминокислот.
 
На очерченный здесь основной процесс ионообменной хроматографии влияет ряд дополнительных факторов. Среди них, кроме уже фигурировавшей ранее затрудненной (особенно для крупных молекул) диффузии внутри гранул, следует назвать возможность неионной адсорбции на поверхности матрицы ионообменника. Однако при правильном выборе материала обменника, и в частности его пористости, основ­ную роль в процессе фракционирования играет явление ионного обмена.
Схема типичного прибора для ионообменной хроматографии представлена на рисунке 3.
 
Рис. 3 Типичная установка ионообменной жид­костной хроматографии для очистки белков. После загрузки образца насос создает солевой градиент для элюции образца.
 

Распределительная хроматография

           Строго говоря, так следует назвать хроматографическии процесс, в котором неподвижная и подвижная фазы представлены двумя несмешивающимися или частично смешивающимися жидкостями. Если в системе двух контактирующих между собой жидкостей такого рода растворять какое-либо вещество, то его концентрация в этих растворителях будет одинакова только в том случае, если оба они обладают одинаковой растворяющей способностью, т. е. одинаковым сродством к веществу. В противном случае молекулы вещества будут переходить из одной жидкости в другую до тех пор, пока не установится равновесие, которому будет отвечать более высокая концентрация этих молекул в той жидкости, растворяющая способность которой выше. Если такие жидкости представляют собой неподвижную и подвижную хроматографические фазы, то распределение вещества между фазами происходит в соответствии с растворимостями в них компонентов исходной смеси, причем для каждого компонента — независимо от всех других (если, разумеется, свойства самих растворителей при этом не изменяются). Чем выше сродство данного компонента к неподвижной фазе, тем медленнее он мигрирует вдоль колонки или пластинки.

         Жидкость неподвижной фазы, как и при гель-фильтрации, мо­жет быть просто иммобилизована внутри пористых гранул, или, например, быть прочно связана с волокнами набухшей целлюлозы, или же покрывать тонкой пленкой гранулы из сплошного материала и поверхность пор внутри них. Покрытие может осуществляться за счет смачивания, сорбции или химическим путем. В последнем случае нередко «пленка» жидкости сводится к мономолекулярному слою вещества, способного удерживать близ своей поверхности молекулы компонентов фракционируемой смеси в соответствии со степенью их сродства к нему. В этом случае о соотношении растворимостей говорить трудно, так что лучше оперировать только поня­тиями «сродства» того или иного компонента к неподвижной и под­вижной фазам, что, впрочем, с позиций теории хроматографии сведется к точно такой же, как при истинном растворении, количествен­ной характеристике равновесного распределения фракционируемого материала между двумя фазами. Если в процессе распределитель­ной хроматографии участвуют две истинные жидкости, то для осу­ществления равновесного распределения вещества они сами тоже должны быть в равновесии между собой, т. е. в случае частичной их растворимости друг в друге должны быть взаимно насыщенными.

         Очень часто одна из фаз обогащена органическим растворителем, в то время как другая является в основном водной. Естественно, что в этом случае фракционирование веществ идет по степени их гидрофобности. Исторически сложилось так, что «нормальным» расположением фаз называют такое, при котором неподвижной является водная фаза. За счет смачивания (набухания) она легко фиксируется на гидрофильных матрицах (целлюлозе, полиакриламидном или декстрановом гелях, диатомовых землях, силикагеле и др.). В состав подвижной фазы в этом случае входят органические растворители. При обратном расположении фаз, когда на твердой матрице фиксируют пленку органического растворителя, а подвиж­ная фаза представляет собой водный раствор, распределительную хроматографию называют хроматографией в обращенных фазах (ХОФ). В английской литературе ее обозначают RPC (reversed phase chromatography). ХОФ при высоком давлении нередко осущест­вляют таким образом, что неподвижная фаза вместо пленки органи­ческого растворителя представлена монослоем молекул жирного или ароматического ряда, химически закрепленных на поверхности твердой матрицы силикагеля. В качестве матриц для ХОФ с истин­но жидкой неподвижной фазой часто используют предварительно силиконированные   диатомовые   земли   типа   кизельгуров.

Классификация по расположению неподвижной фазы

Эта классификация не требует особых пояснений. Если пористые гранулы геля или сорбента для любого типа хроматографии запол­няют стеклянную или металлическую колонку, то говорят о хроматографии на колонке, или «колоночной хроматографии», хотя послед­нее выражение относится к категории укоренившегося жаргона. Хроматографию на колонке во многих случаях теперь ведут при очень большом давлении подачи элюента (до 300—400 атм), что позволяет уменьшить диаметр гранул до 5—10 мкм с вытекающими отсюда (см. ниже) существенными преимуществами в быстроте и качестве фракционирования микроколичеств исходного вещества. За это приходится расплачиваться использованием дорогостоящих стальных прецизионных колонок и специальной аппаратуры, но в случае серийных анализов такие затраты себя оправдывают. Жидкостную хроматографию на колонках при высоком давлении условимся сокращенно обозначать ЖХВД (ВЭЖХ). В английской литературе принято обозначение HPLC, которое расшифровывают как «high pressure   (иногда — high   performance)   liquid   chromatography».
 
Если хроматографический процесс идет в наклонно расположенном, ровном и относительно толстом (несколько миллиметров), открытом с поверхности слое гранул, между которыми жидкость подвижной фазы течет только под действием силы тяжести, то его можно назвать хроматографией в толстом слое. Практически этот метод нашел себе применение только для гель-фильтрации.
 
Тонкий (0,1—0,5 мм) слой гранул, адсорбированных или иным образом закрепленных на поверхности пластинки из стекла или пластика, позволяет осуществлять хроматографию в тонком слое, или «тонкослойную хроматографию» (ТСХ). Английское обозначение TLC (thin layer chromatography). Движение жидкой фазы происхо­дит   за   счет   капиллярных   сил (Рис.1).
 
 
Рис 1. Принцип тонкослойной хроматографии.
 
Видео: плстановка и проявление ТСХ.
 
 
 
Вместо тонкого слоя сорбента на основе целлюлозы можно ис­пользовать просто фильтровальную бумагу, иногда специальную — с введенными в нее ионогенными группами. Соответствующий про­цесс следует называть хроматографией на бумаге (Рис.2).
 
 
 
Рис 2. Бумажная хроматография
 
Вместо бумаги для аналогичного типа хроматографии исполь­зуют пленки из модифицированной целлюлозы, полиамидные пленки и т. д. — это варианты хроматографии на пленках.

Пластинки, бумага или пленка могут располагаться горизон­тально или вертикально; в последнем случае движение подвижной фазы может быть восходящим или нисходящим — это не играет принципиальной роли, так как оно обусловлено в основном капил­лярными силами. Препараты на пластинки или бумагу чаще всего наносят в виде полоски или пятна раствора у одного края сорбента, неподалеку от уровня элюирующей жидкости, в которую этот край погружают. В последнее время для ТСХ все чаще применяют ва­риант кольцевой (радиальной) хроматографии, когда исходный препарат наносят в виде кольца, а элюция идет радиально.


Рис. 3. Разделение при помощи радиальной хроматографии пигментов чернил.

Классификация по способу элюции

Фронтальный анализ

 

Фронтальный анализ состоит в непрерывном пропускании анализируемой смеси через слой сорбента в колонке. Если анализируемая смесь состоит из двух компонен­тов А и В, изотерма сорбции которых линейная, и наиболее слабо сорбирующегося газа Е, то по­следний заполняет весь объем колонки и покидает ее в чистом виде. При этом на хроматограмме фиксируется горизонтальная линия (нулевая линия) (рис. 1). Если компонент А сорбируется слабее чем компонент В, то после насыщения сорбента веществом А из колонки начинает выходить смесь этого вещества с газом Е. На хроматограмме появляется ступень, высота которой соответствует концентрации А в Е на выходе из колонки. Эта концентрация может быть равна или больше исходной концентрации А. Наконец, когда сорбент насыщается также и веществом В, из колонки начинает выходить смесь газа, содержащая все исходные компоненты, а на хроматограмме появляется вторая ступень, высота которой соответствует суммарной исходной концентрации веществ А и В.

 

Так называется вариант хроматографического процесса, когда раствор смеси компонентов непрерывно подается на вход хроматографической колонки. На выходе ее в этом случае появляются один за другим несколько «фронтов» элюата. За первым из них следует чистый, быстрее других мигрирующий в данной системе компонент смеси, отличающийся, очевидно, наименьшим сродством к неподвижной фазе. Второй фронт отмечает добавление к нему следующего по подвижности компонента. За третьим фронтом следует уже смесь трех компонентов, высота которой соответствует суммарной исходной концентрации веществ А и В. В настоящее время по вполне понятным причинам фронтальный анализ почти вышел из употребления и применяется лишь в отдельных, специальных случаях.

Рис.1. Схема образования зон при фронтальном анализе и распределения концентрации в зонах.

 

В случае более сложной смеси исходная концентрация всех компонентов достигается после насыщения сорбента всеми ее компонентами. Таким образом, число ступеней на хроматограмме фронтального анализа равно числу сорбирующихся компонентов смеси. Следовательно фронтальный метод позволяет выделить из смеси в чистом виде только одно, наиболее слабо сорбирующееся вещество. Поэтому для аналитических и тем более препаративных целей фронтальный метод применяется лишь в особых случаях. Фронтальный метод используется также для определения физикохимических характеристик вещества, в частности, для определения изотерм сорбции.

 

Вытеснительная хроматография

В этом варианте в колонку или на стартовую линию хроматографической пластинки наносят определенную порцию раствора исходной смеси веществ, а затем ведут элюцию раствором вещества, обладающего заведомо большим сродством к неподвижной фазе хроматографической системы, чем любой из компонентов смеси. Происходит вытеснение их из неподвижной фазы, причем в первую очередь тех, которые обладают меньшим сродством к сорбенту, а затем и всех остальных. Элюент выталкивает все компоненты смеси впереди себя наподобие поршня. Так как они выходят в подвижную фазу концентрированными, то между ними также идет конкуренция за связь с неподвижной фазой. Компоненты, уступающие другим в силе сродства к этой фазе, оттесняются еще вперед, где сорбируются, но только до тех пор, пока их опять не вытеснят компоненты, обладающие большим сродством к сорбенту. В результате такого чередования сорбции и вытеснения компоненты смеси будут выходить из колонки один за другим в порядке возрастания силы их связи с неподвижной фазой. Ясно, что при этом зоны соседних компонентов будут соприкасаться или даже немного перекрываться друг с другом (Рис.2).

Рис.2 Схема образования зон в вытеснительном методе и распределения концентрации веществ в зонах.

В отличие от хроматографической элюции, в вытеснительном методе компоненты смеси не разбавляются промывающим веществом, вследствие чего их концентрация не только не уменьшается, но даже увеличивается. Для аналитического фракционирования метод непригоден, но хорош для препаративного или полупромышленного разделения веществ, поскольку емкость колонки здесь используется очень эффективно.
В чистом виде вытеснительный метод в газовой хроматографии применяется срав­нительно редко, главным образом при определении микропримесей, а таже

Хроматографическая элюция

В отличие от предыдущих в этом методе элюирующий раствор обладает меньшим сродством к сорбенту, чем любой из компонентов вносимой на колонку или пластинку смеси веществ. Эти компоненты постепенно «вымываются» из неподвижной фазы и движутся вдоль колонки за счет непрерывного перераспределения их молекул между неподвижной фазой и элюентом. Каждый из них мигрирует независимо от других в соответствии с соотношением сил его срод­ства к неподвижной и подвижной фазам. Миграция идет тем медлен­нее, чем больше сродство к неподвижной фазе. При хроматографической элюции компо­ненты смеси выходят из колонки отдельными, разделенными друг от друга зонами, которые в соответствии с типичной формой профиля распределения вещества в каждой такой зоне часто на­зывают хроматографическими пиками. Именно этот, при­годный как для аналитических, так и для препаративных целей вариант хроматографии наиболее широко распространен и будет наиболее подробно рассмотрен в следующих разделах.

Для наглядности на рисунке 3 схематически показано разделение трехкомпонентной смеси при использовании различных способов элюции.

 

Рис.3 Различия разделения смесей по способу элюции. 3а - хроматографическая элюция; 3б - фронтальный анализ; 3в - вытеснительная хроматография.

 

Сорбенты

Первым сорбентом, применяемым в хроматографии был порошок мела, на котором первооткрыватель хроматографии М.С.Цвет разделил пигменты хлорофила. Как и любой исследовательский метод, хроматография всегда стремилась расширить область своего применения: анализ количественного и качественного состав веществ, а также их выделения в чистом виде из всех доступных данному методу субстратов. Одним из способов увеличения универсальности метода является подбор оптимального субстрата обладающего определенными свойствами. При развитии метода было выяснено, что наилучшими свойствами для хроматографического разделения обладают стабильные в своих физических и химических свойствах при эксперименте вещества с высокоразвитой поверхностью. Порошок мела данным требованиям не соответствовал и поэтому были найдены сначала природные вещества, соответствующие нужным критериям (кизельгур, силикагель, целлюлоза и т.д.), а затем, при развитии теории хроматографии и соответствующих разделов органического синтеза, были разработаны и созданы сорбенты с заданными свойствами.  

Современные сорбенты (матрицы) имеют вид сплошных или пористых гранул; последние часто представляют собой пространственную сетку линейных полимеров. Для придания материалу матрицы необходимых для хроматографии свойств его модифицируют. Модификация может представлять собой химическое присоединение (присадку) ионогенных групп, гидрофобных молекул, биологически активных веществ или фиксацию путем адсорбции тонкого слоя растворителя. Хотя особенности хроматографического процесса определяются в основном характером модификации, физико-химические параметры матрицы могут существенно влиять на свойства неподвижной фазы. К таким параметрам относятся следующие: размеры и форма гранул и их пор; диапазон разброса этих размеров; механическая прочность материала матрицы; характер его смачивания и набухания в элюенте; химическая стойкость и инертность в условиях хроматографической элюции; реакционная способность, обеспечивающая возможность химической модификации матрицы.
Одни и те же матрицы, по разному модифицированные, могут образовывать неподвижную фазу для разных хроматографических методов, поэтому в данном разделе мы познакомимся с физико-химическими свойствами основных применяемых в настоящее время матриц, а их модификации (а также свойства и номенклатуру получаемых путем этих модификаций сорбентов) можно почерпнуть из специализированной литературы, представленной на сайте и в каталогах производителей. Прежде чем перейти к анализу свойств различных матриц, укажем общие для них способы обозначения диапазона линейных размеров гранул (а для сфер — их диаметров). Этот диа­пазон указывают либо непосредственно в микронах, либо в виде интервала чисел «МЕШ» («mesh»). Число МЕШ соответствует числу нитей на дюйм в сетке с квадратными ячейками, через которую просеиваются гранулы. С учетом толщины самих нитей это означает, что через сетку в 100 МЕШ пройдут все гранулы, максимальный размер которых меньше 160 мкм, через сетку в 200 МЕШ — меньше 80, 400 МЕШ — меньше 40. Таким образом, диапазон размеров гранул 40—80 мкм соответствует 200—400 МЕШ. В него попадут гранулы, которые просеиваются через сетку в 200 МЕШ, но не проходят через ячейки сетки в 400 МЕШ. Для мелких гранул, размер которых менее 40 мкм,   принято обозначение —400   МЕШ.

Сорбенты на основе природных матриц

Целлюлоза

Микрогранулированная целлюлоза

Волокнистая целлюлоза

Гели на основе декстрана (сефадексы)

Агароза

Кизельгур (целит, диатомовая земля)

В данном разделе мы рассмотрим основные типы сорбентов, основу которых составляют природные матрицы или их модификации. Некоторые из представленных матриц широко применяются в настоящее время (сефароза, сефадексы), а некоторые (целлюлоза, кизельгур) постепенно утрачивают свои позиции, но еще могут встречаться в лабораториях, поэтому в ознакомительных целях приведены свойства всех матриц.

Целлюлоза

Это — полисахарид, линейный полимер, образованный остатками глюкозы, связанными ß-1,4-глюкозидной связью (Рис.1). Каждое звено глюкозы несет три свободные гидроксильные группы. Таким образом, нить полимера представляет собой полиатомный спирт. Применяется в ЖХ. Для
целлюлозы характерны высокая степень гидрофильности и склонность к образованию многочисленных водородных связей между нитями полимеров. Наличие множества гидроксильных групп позволяет легко модифицировать целлюлозу путем химического присоединения разнообразных заместителей, например ионогенных групп или биологически активных молекул. Вместе с тем сама целлюлоза химически достаточно инертна и не вступает в реакции с белками, нуклеиновыми кислотами и их компонентами. Этого, к сожалению, нельзя сказать о возможности сорбции биологических молекул на целлюлозе, на чем придется подробнее остановиться ниже. Целлюлоза неустойчива к воздействию сильных кислот, щелочей и окислителей. Она выдерживает контакт с минеральными кислотами и щелочами, концентрация которых не превышает 0,5 н., и то не более 2 ч при комнатной температуре. Рабочий интервал рН для обменников на основе обычной целлюлозы составляет 3—10. Целлюлоза охотно атакуется микроорганизмами даже на холоду,. поэтому ее водные суспензии хранят в присутствии антисептиков (например, 0,02% NaN3).
Рис.1. Химическая форма целлюлозы.
Водородные связи между линейными цепями целлюлозы на отдельных участках могут образовывать псевдокристаллические структуры, которые чередуются с более рыхлыми, аморфными областями — «порами». Так формируются макроскопические нити целлюлозы,, легко набухающие в поперечном направлении. «Кристаллические» участки малодоступны для присоединения модифицирующих заместителей, которые из-за этого располагаются главным образом на поверхности нитей и в порах. В целом получается микрогетерогенная структура, характер которой зависит от исходного материала и технологии обработки целлюлозы. По этой причине-свойства целлюлозы, в том числе хроматографические, могут весьма заметно варьировать не только у различных фирм, но н от партии к партии. Следует постоянно иметь в виду это обстоятельство и от­рабатывать режим хроматографии заново для каждой новой партии сорбента на основе целлюлозы. Весьма существенно также представ­лять себе влияние сушки на свойства целлюлозы. При удалении воды образуется множество дополнительных водородных связей на аморфных участках матрицы, так что объем пор резко уменьшается. Далеко не все эти связи разрываются при простом замачивании целлюлозы в воде, поэтому необходима специальная обработка («cycling») как сухой продажной целлюлозы, так и уже использованного сорбента после каждого его высыхания. Такая обработка заключается в суспендировании целлюлозы в 15 объемах 0,5 н. NaOH на 30 мин и последующей промывке водой на фильтре до рН 8. Смысл этой обработки — в диссоциации ОН-групп, после чего нити «расталкиваются» взаимодействием отрицательных зарядов, а дополнительные водородные связи рвутся. Ионообменники на основе целлюлозы обрабатывают аналогично, для чего их суспендируют в 0,5 н. растворе кислоты или щелочи в зависимости от типа ионо-обменника. При набухании 1 г сухой целлюлозы связывает около 2,5 г воды.

Микрогранулированная целлюлоза

Для повышения жесткости проводят частичный кислотный гидролиз целлюлозы, разрушающий аморфные участки матрицы. На их место для сохранения пористости между «кристаллическими» участками вводят химические сшивки; одновременно увеличивается степень «кристалличности», а поры становятся просторнее. Такую целлюлозу выпускают многие фирмы под названием «микрогранулированная целлюлоза». Помимо повышенной жесткости, она более гомогенна, что обеспечивает более высокую по сравнению с обычной (волокнистой) целлюлозой разрешающую способность. Микрогранулированная целлюлоза представляет собой уже не длинные нити, а гранулы продолговатой формы с соотношением линейных размеров порядка 5 : 1 и диаметром эквивалентной сферы около 50 мкм, а для тонкослойной хроматографии — около 8 мкм. Микрогранулированная целлюлоза хорошо упаковывается в колонку, но отличается большим сопротивлением току элюента («хуже течет»), чем волокнистая целлюлоза.

Волокнистая целлюлоза

Продажные препараты с таким названием сохраняют описанную выше структуру относительно длинных нитей с аморфными участками, хотя и они проходят специальную обработку для увеличения степени кристалличности и освобождения от мелких «обрывков» нитей. Колонки, заполненные волокнистой целлюлозой, заметно лучше «текут», но не обеспечивают тонкого фракционирования. Их целесообразно использовать на ранних стадиях очистки биополимеров.
Целлюлозные матрицы в чистом виде используются для нормальнофазовой распределительной хроматографии (главным образом, при ТСХ), а модифицированные — в ионообменной и аффинной хроматографии.

Гели на основе декстрана (сефадексы)

Декстран также представляет собой полисахарид — в основном линейный полимер   на основе глюкозы, где звенья связаны β-1,6-глюкозидной связью (рис. 2). 
Рис.2. Химическая форма декстрана.
Это тоже   полиатомный   спирт с высокой степенью гидрофильности, предоставляющий столь же широкие, как и целлюлоза, возможности для модификации и также химически инертный. Устойчивость к действию кислот у декстрана еще меньше, чем у целлюлозы. Его не следует обрабатывать более крепким раствором, чем 0,1 н. НС1 (в течение 2 ч). К щелочи гели на основе декстрана более устойчивы: они сохраняют свои свойства в 0,25 н. NaOH   до 2 мес даже при температуре 60оС. Рабочий диапазон рН составляет 2-12. Существенное отличие от целлюлозы состоит в том, что нити декстрина не образуют агрегатов, так как они не вполне линейны — имеются достаточно многочисленные ветвления (по связям 1.2-, 1,3- и 1,4-).
 
Рис.3. Химическая форма сефадекса.
В гелях для хроматографии («сефадексах») нити декстрана хими­чески  сшиты эпихлоргидрином (рис. 3). Однако сшивка не очень жесткая: сефадексы относительно мягки и легко сжимаются, а в водных растворах сильно набухают. Бее ути качества выражены тем сильнее, чем меньше процентное со­держание эпихлоргпдрина. Изменяя долю сшивки, можно регулировать средний размер пор, образуемых пространствен­ной сеткой сшитого геля. Ввиду статис­тического распределения сшивок по объ­ему геля разброс размеров пор невелик, и сефадексы заметно более гомогенны, а свойства их лучше воспроизводимы, чем у целлюлозы. Они «не боятся» высу­шивания и при замачивании не требуют никакой специальной обработки. Сефаде­ксы можно автоклавировать как в сухом, так и во влажном виде — в нейтральной среде при 120оС в течение 30 мин. Суспен­зию сефадекса (набитую колонку) следует хранить с антисептиком, так как он, по­добно целлюлозэ, легко атакуется микроорганизмами. Сефадексам присуща некоторая адсорбционная способность по отношению к аро­матическим и гетероциклическим молекулам, которую даже удается использовать для фракционирования нуклеиновых оснований,аро­матических аминокислот и пептидов. Кроме того, продажные сефа­дексы содержат в своей структуре небольшое количество карбоксиль­ных групп, что придает им некоторое сродство к катионам. При хроматографии его легко подавить введением в элюент соли в кон­центрации около 0,02 М.
Мягкость сефадексов (особенно слабосшитых) накладывает огра­ничения на допустимые значения скоростей хроматографическон элюцпи, которые подробно рассмотрены ниже. По этой же причине определенные сложности возникают при использовании ионообмеиников па основе сефадексов: за счет сил электростатического оттал­кивания своих ионогенных групп они склонны деформироваться при изменении ионной силы элюонта. Все это привело к разработке в последние годы ряда более жестких матриц, вытесняющих сефадексы из традиционных областей их применения — гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. 

Агароза

Как и две предыдущие матрицы, агароза является полиса­харидом, т. е. полиатомным спиртом. Ее элемен­тарным звеном служит дисахарид агаробиоза. в сос­тав которого входит необычный сахар - 3.6-ангидро-L-галактоза. Из-за этого агароза более устойчива к действию микроорганизмов, чем целлюлоза и сефадексы, однако ее тоже следует хранить в при­сутствии антисептика. Агароза очень гидрофильна, а ее полимерные нити еще в большей степени, чем нити целлюлозы, склонны к образованию водородных связей. Благодаря этому горячий 2-6%-ньтй раствор агарозы застывает в виде жесткого и очень крупнопористого геля. Нити поли­мера собираются в пучки и образуют жест­кий пространственный каркас с пустотами внутри. При температуре около 100°С гель агарозы плавится, поэтому его нель­зя автоклавировать: в случае необходимос­ти гель приходится стерилизовать раство­ром диэтилпирокарбоната. Модификация агарозы может происходить также по гидроксильным группам, плотность расположе­ния  которых,   однако,    значительно   ниже, чем у сефадексов, поскольку на звено дисахарпда их приходится четыре вместо шести. Положение усугубляется тем, что внут­ри плотно упакованных пучков нитей гидроксильные группы недоступны для модификации. В условиях хроматографии агароза химически неактивна, но уязвима для действия кислот, щелочей и окислителей. Рабочий диапазон рН при использовании матриц из обьгчной агарозы лежит в пределах 4-9. Агароза выдерживает не­продолжительный контакт с 8 М мочевиной и 6 М гуанидиихлоридом, которые все же постепенно ее разрушают.Поскольку агароза для хроматографии представляет собой вод­ный гель, о набухании ее говорить не приходится. Но следует пом­нить о том, что агарозу нельзя сушить ввиду необратимой деструкции геля. Агароза для хроматографии поставляется в виде суспен­дированных в воде сферических гранул диаметром 60— 200 мкм, ко­торые в таком виде и следует хранить. При кратковременном обсы­хании колонки, заполненной агарозой, пока гранулы не начали терять находящуюся в них жидкость, хроматографнческне характеристики сорбента еще могут быть восстановлены. Если же подсыхание гранул началось, то гель приходится выбрасывать (разумеется, его можно расплавить и использовать, например, для электрофореза, но грану­лированная структура будет уже утрачена). Размер пор (пустот) в гранулах зависит от процентного содержания агарозьг в геле (2, 4 или 6%). Связанные с агарозой остатки сульфокислоты (до 0,5% по мас­се) могут сорбировать щелочные белки. Эта сорбция подавляется в присутствии 0,02 М NaCi или другой соли. Гранулированную агаро­зу для гель-фильтрации и синтеза аффинных сорбентов выпускают следующие фирмы: «Pharmacia» — под торговым названием «Sepharose», «Bio-Rad» — под названием «Bio-Gel A», «LKB» (Швеция) и «IBF» (Франция) — под названием «Ultrogel А».
Для повышения химической и термической стойкости матриц фирма «Pharmacia» разработала вариант гелей агарозы, в которых нити полимера дополнительно химически «сшиты» обработкой 2,3-дибромпропанолом в сильно щелочной среде. Матрицы на основе такой «сшитой» агарозы носят общее наименование «Sepharose CL». Их можно использовать в значительно более широком диапазоне рН (3—14) и даже автоклавировать при температуре 120оС. Они об­ладают еще большей жесткостью, выдерживают длительный контакт с 8 М мочевиной и 6 М гуанидинхлоридом, а также со многими орга­ническими растворителями (этанолом, ацетоном, хлороформом, пи­ридином, ацетонитрилом, дихлорэтаном, ДМФ, ДМСО и др.). Послед­нее обстоятельство имеет важное значение для осуществления реак­ций модификации.
В настоящее время агаргоза широко применяется как в колоночной хроматографии в виде модифицированных сорбентов состоящих из сферических гранул строго определенного размера (Q-Sepharose, SP-Sepharose, Phenyl-Sepharose и т.д.), так и в виде гелей, в основном применяемых для элерофоретического разделения нуклеиновых кислот при молекулярнобиологических и биотехнологических исследованиях.

Кизельгур (целит, диатомовая земля)

Под этими названиями фигурирует большое число различных крупнопористых материалов, представляющих собой окаменевшие панцири древних диатомовых водорослей. Кизельгуры примерно на 90 % состоят пз SiO2, а также содержат 4 % Аl2О3 и менее значитель­ные примеси окислов других металлов, в том числе около 1,4% Fe2O3. Окислы железа удаляют обработкой 10%-ной НСl, материал сушат при 110°С, перемалывают, отсеивают и поставляют в виде жест­ких и очень пористых гранул. Они гидрофильны, химически инертны и обладают высокой адсорбционной способностью.  Кизельгуры ши­роко используют в качестве основы матриц для распределительной хроматографии в обращенных фазах. Для этой цели поверхность гранул и пор силиконируют обработкой парами диметилдихлорсилана и промывают метанолом. Из особо хорошо очищенных кизель­гуров типа «Chromosorb», выпускаемых главным образом в качестве носителей для газовой хроматографии, для целей жидкостной ХОФ лучше всего подходит спликонпрованный «Chromosorb W» (фирма «Johns-Manville»). На 1 г этого сорбента можно иммобилизовать до 0,9 мл неполярной жидкости, служащей неподвижной фазой для ХОФ.

Сорбенты на основе ситетических матрицах


Полиакриламидный гель

Сефакрилы

Ультрагели типа АсА

Полистирольные смолы

Полиамидные смолы

Силикагель

Окись алюминия

Пористое стекло

Оксиапатит

 

Полиакриламидный гель


Нити линейного полимера акриламида, сши­тые N.N'-метиленбисакриламидом, образуют относительно жесткую и химически инертную пространственную сетку геля, хорошо удер­живающую воду. Пористость и жесткость геля определяется про­центным содержанием в нем полимера. Гранулированные матрицы полиакриламидного геля (ПААГ) используются только для гель-фильтрации. Рабочий диапазон рН — 3-8. Гель можно автоклавировать; он выдерживает контакт с разбавленными органическими кислотами. 8 М мочевиной, 6 М гуанпдинхлоридом,   детергентами.   В  отличие   от  агарозы ПААГ  «не боится» высушивания. Матрицы поставляются и виде сухих сферичес­ких гранул нескольких диапазонов диаметров в интервале от 40 до 300 мкм. При замачивании они сильно набухают и могут связывать, в зависимости от содержания ПААГ, от 3 до 30 мл воды на 1 г су­хих гранул.
Полиакриламидпые патрицы выпускают фирмы «Bio-Rad» (под общим названием «Bio-Gel P») и «Roanal» (под названием «Акрилекс»). На основе полиакриловой кислоты выпускают также ионообменники — «Trisacryl» (фирма  «LKI3») и «Bio-Rex 70» (фирма «Bio-Rad»).
В целях объединения достоинств описанных выше материалов было создано два новых типа комбинированных матриц — «Sephacryl» и «Ultrogel AcA».

Сефакрилы


Рис. 1 Структура полиэтиленбисакриламида.


Торговое название «Sephacryl» получила разработанная фирмой «Pharmacia»
матрица для гель-фильтрации на основе декстрана и N,N'-метиленбисакриламида (Рис.1). В ней удачно сочетаются качества сефадексов и ПААГ — нити декстрана и полимерные нити метилеп-бисакриламида (он способен полимеризоваться в нити подобно акрил-амиду химически связаны друг с другом.
Структура полиэтиленбисэкрила.иида Получается очень жесткий гель, пористость которого легко контро­лировать. Он гидрофилен, химически инертен, выдерживает контакт с 8 М мочевиной, 6 М гуанидинхлоридом, детергентами и органиче­скими растворителями; его можно автоклавировать при 120oС. Рабо­чий диапазон рН — 2-11. Благодаря своей жесткости сефакрил мо­жет быть использован при значительно больших скоростях элюции, чем сефадекс с такой же пористостью. Адсорбция здесь несколько более заметна, чем у сефадексов, особенно при кислых значениях рН (ее подавляет 0,05 М NaCl). Сефакрил поставляется в виде сус­пензии набухших гранул с размерами 40—105 мкм.

Ультрагели типа АсА


«Ultrogel AcA» — еще один вариант жесткой матрицы, обеспечи­вающей широкие возможности выбора размера пор. Здесь контроли­руемая пористость ПААГ сочетается с жесткостью агарозы — сетка ПААГ полимеризуется внутри жесткого каркаса агарозы. Химичес
кой связи между ними нет, но агароза придает жесткость сфери­ческим гранулам ультрогеля, в то время как их пористость опреде­ляет ПААГ. По химической и термической стойкости эта матрица сходна с агарозой; диапазон диаметров гранул — 60—140 мкм. Мат­рицы типа «Ultrogel AcA» с различным содержанием агарозы и ПААГ в виде водных суспензий поставляют фирмы «LKB» и «113F». Эти матрицы нашли применение не только для гель-филь­трации, но и для синтеза аффинных сорбентов на их основе.

Полистирольные смолы
 

Нити линейного полимера полистирола, химически «сшитые» мо­лекулами дивинилбеизола в жесткую пространственную сетку (Рис.2), вы­пускаются в виде сухих сферических гранул под торговым названием «смол» («resins»).

Рис. 2 Структура полистирола


Содержание дивинилбензола варьирует от 2 до 12%, определяя сред­ние размеры пор сетки. Эти ра^геры обычно малы, так что внутрен­ний объем гранул полистирола доступен только для низкомолеку­лярных соединений (иуклеотидов, аминокислот, коротких пептидов и др.). Впрочем, имеются и «макроретикулярные» типы смол на осно­ве полистирола; при их изготовлении микрогранулы смолы спе­каются в гранулы обычных размеров (30—300 мкм). Внутренний объем таких гранул, представленный свободным пространством, остающимся между микрогранулами, доступен для биологических макромолекул.
Немодифицированные полистиролыше смолы гидрофобвы. Моди­фикация осуществляется присоединением ионогенных групп по остат­кам бензола в пара-положении. Это придает смоле в целом гидро-фильность, хотя возможность и склонность к гидрофобным взаимо­действиям с фракционируемым материалом сохраняется. Для хрома­тографии компонентов белков и нуклеиновых кислот в водных элю-ентах смолы на основе полистирола применяются только в качестве матриц ионообменников. Благодаря частоте расположения в про­странстве остатков бензола эти матрицы отличаются высоким содер­жанием ионогенных групп. Химически они очень устойчивы (можно промывать 4 н. НС1 и 2 н, NaOH) и выдерживают нагревание до 120°C. При замачивании гранулы набухают, связывая (в зависимости от пористости) от 1 до 3 мл воды на 1 г сухой смолы. Макроретнкуляр-ные ионообмешшки на основе полистирола можно, вообще говоря, использовать для
хроматографии белков, но при этом следует опа­саться денатурации за счет гидрофобных взаимодействий белковых глобул с материалом матрицы. Для липофильных белков мембран такое взаимодействие, по-видимому, опасности не представляет.
Наиболее популярные ионообменники на основе полистирола вы­пускаются под торговыми названиями «Dowex» (фирма «Dow Che­mical Со») и «Amberlyte» (фирма «Rohm and Haas») и перепродаются большинством фирм, торгующих биохимическими реактивами. Хоро­ню промытые и отсеянные обменники тина «Dowex» для аналитичес­ких целей поставляет фирма «Bio-Rad» под наименованием «Bio-Rad AG». Повышенные требования, предъявляемые к ионообменникам для современных аминокислотных анализаторов, привели к разра­ботке специальных полистирольных смол («Aminex», «Durrum» и др.) с малым разбросом размеров около номинальных значений порядка 10—20 мкм. Для высокоэффективной хро.матографии при высоких давлениях (ЖХВД) производят так называемые «пленочные ионо-обменники, у которых пленка полистпрольной смолы толщиной около 1 мкм фиксирована на поверхности стеклянных шариков диаметром 4 мкм («Whatman-Pellionex»).
 

Полиамидные смолы

Название «полиамиды» объединяет группу различных гетероцеп-ных полимеров, содержащих повторяющуюся амидную группу —СО—NН—. Они могут быть получены путем гомополиконденсации аминокарбоновых кислот (например, е-аминокапроновой кислоты), иногда с образованием лактамов (найлон-6, капрон). Амидные груп­пы обеспечивают в целом достаточную степень гидрофпльности поли­мера, но и гидрофобные свойства могут быть выражены, причем тем заметнее, чем длиннее углеводородная цепочка исходной аминокарбоновой кислоты. Полиамидные смолы используют главным образом для тонкослойной хроматографии. Они выпускаются в виде порошков или готовых пластинок для ТСХ с полиамидным покрытием. Для целей ЖХВД фирма «Whatman» поставляет готовые хроматографические колонки с пле­ночным адсорбентом «Pellarnidmi», у которого на стеклянных бусах фиксирована пленка найлона-6.

Силикагель

Матрицы и сорбенты на основе силикагеля получили в последние годы очень широкое распространение, особенно для ЖХВД. Бур­ное развитие ЖХВД, особенно в качестве экспресс-метода техно­логического контроля в пищевой, фармакологической и многих об­ластях химической промышленности, а также в клинике, привело к появлению большого числа специализированной аппаратуры и еще большего количества торговых наименований силикагелей для хро­матографии. Ниже мы приведем их далеко не полный список, кото­рый позволит читателю ориентироваться в этом многообразии. Но сначала следует описать общие свойства силпкагельных матриц и вариантов их модификации, поскольку, по-видимому, в ближайшие годы область применения силикагелей расширится за пределы сферы анализа смесей относительно низкомолекулярных соединений на хроматографию белков, нуклеиновых кислот и других биополимеров при умеренных давлениях.

Силикагель («silica gel», «silica») — это аморфное вещество с об­щей химической формулой SiO2*H2O. Закислением раствора силика­та натрия получают золь ортокремневой кислоты (SiO2*2H2O), затем его «состаривают», промывают и сушат. В процессе «старения» золя идет его поликонденсация в микрочастицы, которые затем образуют конгломераты, пронизанные капиллярами (порами) со средним ли­нейным размером в пределах 3—30 нм. Удельная поверхность си­ликагелей может достигать очень больших значений — порядка 600 м2/г. В зависимости от технологии приготовления можно полу­чить различные размеры микрочастиц и пор между ними. От нее весьма существенно зависит и разброс этих размеров, а также по­верхностные свойства материала, что весьма существенно влияет на хроматографическио характеристики матриц. Поэтому не удивительно, что силикагелн различных марок, имеющие, согласно фирменным данным, как будто одинаковые параметры, по-разиому проявляют себя в хроматографнческом процессе.

 

Атомы кислорода находятся в вершинах тетраэдра, что обусловлива­ет более сложную пространственную структуру микрочастиц. Однако сейчас представляют интерес две особенности этой схемы, очевидно, сохраняющиеся и при построении пространственной систе­мы. Во-первых, атомы кремния жестко связаны между собой кисло­родными мостиками; во-вторых, на поверхности микрочастиц, а сле­довательно, в порах и на поверхности гранул силикагеля должны в большом количестве находиться силанольные группы — связанные с кремнием гидроксилы. В результате последнего обстоятельства силикагель очень гидрофилен: силанольные группы охотно образу­ют водородные связи с молекулами воды. Общеизвестно, что силика­гель широко используется в качестве осушителя; по этой же причи­не  он  является прекрасным  сорбентом.

Увлажненный силикагель регенерируют и активируют при тем­пературе 200—400°С. Результаты процесса зависят от выбора темпе­ратуры в этом диапазоне. Прогревание при 150оС ведет к постепенной утрате силикагелем физически связанной (сорбированной) воды, и сорбцнонная способность его увеличивается. В интервале 450—250оС она остается практически неизменной. Нагревание в ин­тервале 250—400°С приводит к отнятию химически связанной воды от наиболее реактивных силанольных групп. Сорбционная способность снижается, но становится более однородной по всей поверхности си­ликагеля. Выше 400°С потеря воды связана с образованием силоксановых мостиков между соседними силанолами, и сорбционная способ­ность падает необратимо. Для получения стандартной адсорбцион­ной способности силикагель после полного высушивания частично дезактивируют, добавляя дозированное количество воды (20—30 мл на 100 м2 общей поверхности). Такой силикагель, сохраняя гидрофильность и высокую адсорбционную способность, практически не связывает воду из атмосферы. Покрытые им пластинки для ТСХ и сорбенты для адсорбционной хроматографии можно длительно хра­нить, но, разумеется, не в слишком влажном воздухе.

Немодифицированный силикагель достаточно инертен, хотя сле­дует помнить, что силанольные группы делают его поверхность слегка кислой. Рабочий диапазон рН для таких силикагелей лежит в нейтральной и кислой областях (рН 3—8). В щелочной среде силикагель приобретает химическую активность, но вместе с тем постепен­но  разрушается   (растворяется) водой.

 До сих пор в большинстве случаев силикагель для ЖХВД вы­пускается в виде гранул неправильной формы. Некоторые фирмы осво­или производство сферических гранул. Один из вариантов техноло­гии, пригодной для этой цели, состоит в получении органических полимеров сферической формы, в которые оказываются погружены коллоидные частицы силикагеля. При высокой температуре полимер выжигают, получая таким образом пористые сферические гранулы, образованные спекшимися микрочастицами  силикагеля.

Химическая модификация силикагеля производится по тем же силанольным группам. Его пористая структура при этом сохраняет­ся. Модификация гл1п;ерилпрогшлсилапом лишает силнкагель ад­сорбционной способности, сохраняя гидрофильность; такая матрица удобна для гель-фильтрации. Модификация алифатическим л цепями различной длины (диметилсилап, октилсилан. октадецилсилан) или присадка фенильного остатка дают возможность получить матрицы для ХОФ (в реакцию модификации иногда вводят ди- или трихлор-силаповые производные радикалов). Введение полярных групп, на­пример — CN, —NO2, —NH2, —N(CH3)2. позволяет получить обменники для нормальнофазовой распределительной хроматографии, (НРХ), а введение неполярных - обменники для обращеннофазовой распределительной хроматографии, (ОФХ). Присадкой ионогенных групп получают ионообменники обоих типов (как правило, сильные). Наконец, как уже упоминалось, немодифицированный спликагель используют для адсорбционной хро­матографии. Таким образом, матрицы на основе силикагеля служат для ЖХВД почти во всем диапазоне хроматографических методов, за исключением лить афинной хроматографии. Остается добавить, что, кроме пористых гранул, модифицированные силикагели приме­няют и для создания матриц пленочного типа, когда стеклянные ша­рики диаметром 30—40 мкм покрывают пористой пленкой силикагеля толщиной около 1 мкм. Ввиду краткости пути диффузии вещест­ва пленочные сорбенты позволяют проводить хроматографический процесс с очень большой скоростью, хотя их емкость, естественно, невелика.


Окись алюминия

Окись алюминия для хроматографических целей («Alumina») по­лучают в результате термического дегидрирования (при 400°С) гид­роокиси алюминия, осажденной в виде золя из раствора алюмината натрия. Ее подвергают старению, в процессе которого образуются прочные пористые конгломераты с удельной поверхностью до 200 м2/г. В зависимости от характера обработки эта поверхность в водной среде проявляет слегка кислые или щелочные свойства или же остается нейтральной. Препарат одной из кристаллических форм окиси алюминия под названием «Alumina CY» поставляется многими фирмами, выпускающими биохимические реактивы, в виде 5—20%-ной взвеси в воде. Он используется для адсорбционного фракциони­рования белков в объеме. Имеются в продаже также и сухие гранулы размером 5 мкм и выше с порами диаметром 60—150 A («BDH», «Bio-Bad»,   «Sigma»).

Окись алюминия используют для ТСХ (часто в виде готовых пластинок) и для колоночной адсорбционной хроматографии. Для ЖХВД в щелочной среде (где силикагель непригоден) также исполь­зуют матрицы на основе окиси алюминия — как сплошь пористые («Merck», «LiChrosorb», «Alox T»), так и пленочного типа («Whatman», «Pellumina»).

Пористое стекло

Путем специальной обработки щелочно-боросиликатного стекла и последующей экстракции растворимого материала удается полу­чить стеклянные шарики с хорошо контролируемым размером пор — типа CPG-10 («controlled pore glass»). В качестве матриц для гель-фильтрации они привлекательны своей жесткостью, химической инертностью и жаростойкостью (при стерилизации). Однако следует иметь в виду, что их поверхность несет небольшой отрицательный заряд и может сорбировать, а иногда и денатурировать белки. По­ристое стекло, ассортимент которого включает 11 размеров пор (от 75 до 3000 А) и два, три или четыре диапазона диаметров шариков (от 20 до 400 МЕТИ), поставляется фирмами «BDH» («Glass granules CPG-10»), «Serva» («CPG-10») и «Sigma» («PG»). Последние две фирмы производят также пористое стекло, у которого поверхностный заряд блокирован химической присадкой глицеридов: «CPG-10 Polyol» («Serva») и «GG» («Glyceryl glass»; «Sigma»).

Оксиапатит

Как известно, фосфат кальция (брушит; СаHРО4*2Н2О) в воде нерастворим, но может давать суспензию очень мелких кристаллов (размером около 30 мкм), обладающих высокой адсорбционной спо­собностью. Его получают, сливая растворы СаСl2 и NaH2PO4. При рН >7 брушит постепенно превращается в оксиапатит, который можно представить брутто-формулой Са5(РО4)ОН. Это превращение можно ускорить обработкой щелочью. Из суспензии оксиапатит можно отделить и вы­сушить после промывки этанолом; и ацетоном. Кристаллы окснапа-тпта хрупки и легко крошатся, поэтому он требует осторожного обращения (в частности, нельзя допускать замерзания суспензии оксиапатита). Заполненные им колонки плохо «текут», поэтому приходит­ся работать с   широкими и короткими колонками. Оксиапатит используется в качестве сорбента для белков и нуклеи­новых кислот. Основную роль в адсорбционном взаимодействии, по-видимому, играют ионы Са+, находящиеся на поверхности кристал­лов. 1 г оксиапатита может сорбировать около 10 мг белка или 1 мг ДНК. Десорбцию ведут фосфатным буфером, а в некоторых случаях — раствором соли. Оксиапатит поставляется в виде суспен­зии в разбавленном Nа-фосфатном буфере или в виде порошка.


Хроматографическое оборудование

Сколь велико разнообразие хроматографических методов, столь велико и разнообразие хроматографического оборудования, позволяющего разделить, определить (качественно и количественно), очистить и выделить необходимые вещества из практически необъятного разнообразия органических и неорганических субстратов. В связи с этим для ориентации во всем этом многообразии все оборудование, представленное на рынке можно классифицировать используя приведенную ранее классификацию методов хроматографического разделения, так существует классификации оборудования по: расположению неподвижной фазы, агрегатному составу фаз, цели проведения и давлению в хроматографической системе. Также, в связи с модульностью (особенно аналитического оборудования) оборудование подразделяется на основные блоки: блоки отбора проб (автосамплеры), насосы, хроматографические колонки, термостаты колонок, детекторы и коллекторы фракций - которые, в свою очередь, могут подразделяться как по конструкционным особенностям и характеристикам, так и по предназначению.

Для успешной работы все эти особенности необходимо учитывать еще на стадии закупки оборудования отталкиваясь от поставленной задачи. К сожалению, в настоящее время, особенно в нашей стране, очень трудно найти объективную информацию об истинных характеристиках оборудования, представленного, в основном, дистрибьютерами западных фирм (красочные презентации можно использовать только для предварительного ознакомления). Поэтому надеемся, что данный сайт станет той площадкой, где использующие конкретное оборудование исследователи поделяться, к общей, пользе своими характеристиками используемого оборудования и програмного обеспечения. Данный же раздел посвящен принципиальным особенностям и устройству основных блоков оборудования.
 

Детекторы

Со времен открытия хроматографии был предложен целый ряд хроматографических методов, основой которых является процесс распределения компонентов анализируемой смеси между двумя фазами с последующим их разделением, происходящим вследствие перемещения подвижной фазы вдоль неподвижной. 

В настоящее время наибольшее распространение получили методы газовой, жидкостной и тонкослойной хроматографии, в которых подвижной фазой является газ-носитель или жидкий элюент с введенной в него пробой разделяемых компонентов, а неподвижной — адсорбент или жидкая фаза, нанесенная на соответствующий инертный носитель. Эти методы широко используются для целей анализа и контроля промышленных процессов. С помощью хроматографии решаются многие задачи в области химии, биологии, биотехнологии, медицины, физической химии и других наук. Хроматографические методы анализа начинают широко  применяться  в  космических исследованиях.

Представленный тут материал по хроматографическим детекторам достаточно полно, освещает достигнутые к настоящему времени успехи в этой области. Дальнейшее развитие хроматографии немыслимо без развития новых и совершенствова­ния  существующих методов детектирования.

 

Алфавитный указатель

А Б В Г Д Е Ж З И К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч  Ш  Щ  Э Ю Я
 
A
ААС — атомно-абсорбционная спектроскопия
АД — акустический детектор
АМД — амперометрический детектор для жидкостной хроматографии
АЭС — атомно-эмиссионный спектрометр (спектрометрии)

БУДТП — блок управлении детектора по теплопроводности

ВАД — вольтамперометрический детектор для жидкостной хроматографии
ВД — детектор вязкости
ВЧД — высокочастотный детектор

ГД — гравиметрический детектор
ГЖХ — газожидкостная хроматография
ГХ — газовая хроматография (газовый хроматограф)
ГПХ —гель-хроматография

ДАФ — детектор азотно-фосфорный (ДТИ)
ДБ — детектор биологический
ДБВ — детектор высоковакуумный
ДГ — детектор гальванический
ДД — детектор дифференциальный
ДДП — детектор давления паров
ДДС — детектор двойных связей
ДЕД — деструктивный детектор
ДКА — детектор коаксиальный аргоновый
ДКМ — детектор кулонометрический для ГХ
ДМ — денситометр
ДП — детектор по плотности
ДПД — детектор по диэлектрической постоянной
ДПИ — детектор пламенно-ионизационный
ДПЛ — детектор поляриметрический
ДПО — детектор потенциометрический
ДПП — детектор потенциала поверхности
ДПР — детектор постоянной скорости рекомбинации
ДПС — детектор по сечению ионизации
ДПТ — детектор полупроводниковый тонкопленочный
ДПУ — детектор—пневматический   усилитель в качестве детектора
ДПФ — детектор пламенно-фотометрический
ДПФ-Ф — ДПФ в режиме анализа фосфора
ДПФ-С — ДПФ в режиме анализа серы
ДПЭ — детектор плазменный эмиссионные
ДПЭ-ИС — индуктивно связанный ДПЭ
ДПЭК — детектор по подвижности электронов косвенный
ДПЭЛ — детектор пьезоэлектрический
ДПЭ-М — ДПЭ микроволновой
ДПЭП — детектор по подвижности электронов прямой
ДПЭ-ПТ — ДПЭ постоянного тока
ДР — детектор разрядный
ДРА — детектор по радиоактивности дли ГХ
ДСП — детектор сопротивления потоку
ДТА — детектор теплоты адсорбции
ДТАН — дифференциальный термический анализатор
ДТИ — термоионный детектор (ТИД, ТАД, Na-ТИД, ДАФ н др.)
ДТП — детектор по теплопроводности
ДТП-К — ДТП с конверсией
ДТП-Т — термисторный ДТП
ДТХ — детектор термохимический
ДУФ — детектор по поглощению ультрафиолетового света для ГХ
ДФИ — детектор фотоионизациоииый
ДФИ-Р — разрядный ДФИ
ДФИ-УФ — ультрафиолетовый ДФИ
ДХЛ — детектор хемилюминесцентиый для ГХ
ДХЛ-НА — ДХЛ для анализа нитрозоамииов
ДЭ — детектор электрический
ДЭЗ — детектор электронозахватный
ДЭП — детектор по электропроводности для ГХ
ДЭПК — детектор по электропроводности Кулсоиа
ДЭПХ — детектор по электропроводности Холла

ЕМД — емкостный детектор
е. о. п. — единица оптической плотности
е. п. п. — единица показателя преломления

ЖХ — жидкостная хроматография (жидкостный хроматограф)

ИД — интегральные детекторы
ИК — инфракрасный (инфракрасная/область спектра)
ИКД — инфракрасный детектор для ГХ и ЖХ
ИКД-П — ИКД с переменной длиной волны
ИКС— инфракрасный спектрометр
ИКС-ФП — ИКС с преобразованием Фурье (ФПИКС)
ИЛ — ионная ловушка
ИЛ-МС — масс-спектрометр типа «ионная ловушка»
ИОХ — ионнообменная хроматография
ИРД — ионизационно-резонансный детектор

КГХ — капиллярная газовая хроматография
КД — концентрационный детектор
КЖХ — капиллярная жидкостная хроматография (хроматограф)
КК — капиллярная К (колонка)
ККК — кварцевая КК
КЛД — калориметрический детектор
КМД — кулонометрический детектор дли ЖХ
КРД — комбинационного рассеяния детектор

Л
ЛД — лазерный детектор
лД — диапазон   линейности   детектора

М
МГХ — микроколоночиая ГХ
МД — мультидетектор
МДГХ — мультидетекторная ГХ (газовый хроматограф)
МДЖХ — мультидетекторная ЖХ (жидкостный хроматограф)
МЖХ — микроколоночная ЖХ
млн-1 — частей на 106 частей ПФ
млрд-1 — частей на 109 частей ПФ
МПД — микроволновой плазменный детектор (ДПЭ-М)
МС — масс-спектрометрия (масс-спектрометр)

Н
НДД — недеструктивный детектор
НФ — неподвижная фаза
НСД — неселективный детектор

О
ОС — оптическое сканирование пятна в ТСХ
ОСШ — отношение сигнала к шуму
оф-ВЭЖХ — обращенно-фазовая высокоэффективная ЖХ

П
ПАД — пламенно-аэрозольный детектор для ЖХ
ПГД — полярографический детектор для ГХ и ЖХ
ПД — потоковый детектор
ПДК — предельно допустимая концентрация
ПИД — детектор поверхностной ионизации (течеискателъ)
ПЛД — пламенный детектор
ПМД — поляриметрический детектор дли ГХ я ЖХ
ПМД-Н — непрямой ПМД
ПМР — проточная магниторезонансная спектроскопия (ПМР-спектрометр)
ПОД — поляризационный детектор
ПФ — подвижная фаза
пф-ВЭЖХ — прямофазовая высокоэффективная ЖХ
ПФД — пламенно-фотометрический детектор для ЖХ
ППД — потенциометрический детектор для ЖХ
ПЦД — потенциометрический детектор
ПЭД — пироэлектрический детектор
ПЭС — плазменно-эмиссионный спектрометр
 
Р
РАД — радиоактивности детектор для ЖХ
РАД-Р — РАД реакционный
РАД-С — РАД сцинтилляционный
РМД — рефрактометрический детектор (рефрактометр)
РМД-И — РМД интерференционный
РМД-О — РМД по отклонению
РМД-Ф — РМД Френели
РМД-Х — РМД на основе эффекта Христансена

С
СД — селективный детектор
СКР — спектрометр комбинационного рассеяния
СКК — стеклянные капиллярные колонки
СКО — среднее квадратическое отклонение
СКФХ – сверхкритическая флюидная хроматография
СКФЭ- сверхкритическая флюидная экстракция
СО- сканирование образа пятна в ТСХ
СПФ- спектрофотометр (спектрофотометрический детектор)
СРД- светового рассеяния детектор
СФД- спектрофотометрический детектор

Т
ТАД – термоаэрозольный детектор
ТАД-А – термоаэрозольный детектор для анализа азота
ТАД-Ф – термоаэрозольный детектор для анализа фосфора
ТГА – термогравиметрический анализ
тгд – термогравиметрический детектор
тлд – лазерный детектор термических линз для ЖХ
тмд– термомеханический детектор для ЖХ
тпд– детектор тока потока для ЖХ
ТРД – транспортные детекторы для ЖХ
трн-1–-частей пробы на 1012 частей ПФ
тСх– тонкослойная хроматография
тсх-д– тонкослойная хроматография под давлением
ТЭА– анализатор термоэнергии для анализа натроаоамкиов
 
У
УД — универсальный детектор
УЗД — ультразвуковой детектор
УФ — ультрафиолетовый (ультрафиолетовая область спектра);
УФД — ультрафиолетовый абсорбционный детектор по поглощению;
УФД-ВИД — УФД в УФ и видимой областях спектра
УФД-Н — непрямой УФД
УФД-П — УФД с переменной длиной волны
УФ Д-Р — реакционный послеколоночный УФД
УФД-ФМ — УФД с фотодиодной матрицей
УФД-Ч — УФД на основе эффекта Черенкова

Ф
ФАД — фотоакустический детектор
ФИД — фотоионизационный детектор для ЖХ
ФИКД — фильтровый ИКД
ФКД — фотокалориметрический детектор
ФДМ — фотодиодная матрица
ФДМД — фотодиодный матричный детектор
ФМД — флуориметрический детектор
ФМД-Н — непрямой ФМД
ФМД-Л — лазерный флуориметрический детектор
ФМД-П — ФМД с переменной длиной волны
ФМД-Р — реакционный послеколоночный ФМД
ФМД-Х — рентгеновский ФМД
ФМД-2ф — двухфотониый ФМД
ФМД-р — ФМД с наведенной β-излучением флуоресценцией
ФМС — спектрофлуориметр
ФПД — детектор фотопроводимости
фУФД — фильтровый УФД
ФФМД — фильтровый ФМД

X
ХЛД — хемилюминесцентный детектор для ЖХ
ХЛД-НА — ХЛД для анализа нитрозоаминов
ХЛД-Р — реакционный ХЛД
ХМС — хромато-масс-спектрометрия (спектрометр)

Э
ЭДЦ — электродинамический детектор для ЖХ
ЭКР — экстраколоночное расширение пиков
ЭМД — эмиссионный детектор
ЭПД — детектор по электропроводности для ЖХ
ЭПД-Ф — фотоэлектропроводимости для ЖХ
ЭПР — электронный парамагнитный резонанс
ЭПРС — ЭПР-спектрометр
ЭФ — электрофорез
ЭХ — эксклюзнонная хроматография
ЭХД — электрохимический детектор

Я
ЯКР — ядерная квадрупольная резонансная спектроскопия (спектрометр)
ЯМР — ядерная магнитная резонансная спектроскопия (спектрометр)
 

Детекторы для газовой хроматографии


Детекторы для ГХ

Детекторы по теплопроводности (ДТП)

Термисторный детектор по теплопроводности (ДТП-Т)

Детектирование по теплопроводности с конверсией (ДТП-К)

Термохимический детектор

Пламенно-фотометрический детектор (ДПФ)

Пламенно-ионизационный детектор (ДПИ)

 

К настоящему времени в ГХ предложено уже более 50 детекторов. Наиболее широко распространенные детекторы для ГХ с кратким описанием принципа их работы представлены в табл. 1.

Таблица 1. Основные типы детекторов в газовой хроматографии и принцип их работы.

Наименование детектора

Аббревиатура

Принцип работы

Классификация

По теплопроводности

ДТП

Регистрируется различие в теплопроводности анализируемого вещества и газа-носителя

Универсальный, недеструктивный, неионизационный

По плотности

ДП

Регистрируется различие плотностей смеси анализируемого вещества с газом-носителем и чистого газа-носителя

Масс-спектрометр

МС

Образование молекулярных  и  фрагментарных ионов при электронном ударе или химической ионизации

Универсальный, деструктивный, ионизационный

Пламенно-ионизационный

ДПИ

Образование и регистрация ионов при сгорании анализируемых веществ в пламени

Универсальный для соединений, содержащих С и  Н, деструктивный, ионизационный

Фотоионизациониый

ДФИ

Фотохимическое образование и регистрация ионов под действием жесткого УФ-излучения на анализируемое вещество

Селективен в зависимости от потенциалов ионизации, недеструктивный, ионизационный

Электронозахватный

ДЭЗ

Захват анализируемым веществом тепловых электронов, образованных при облучении β-частицами или высокоэнергетическими электронами газа-носителя

Селективный, недеструктивный, ионизационный

Ультрафиолетовый

УФД

Поглощение УФ-света специфическим хромофором анализируемого вещества

Селективный, недеструктивный, неионизационный

Микроволновый плазменный

ДПЭ-М

Возбуждение анализируемого вещества в микроволновой плазме и излучение света на длине характеристической волны присутствующего в веществе элемента

Пламенно-фотометрический

ДПФ

Возбуждение анализируемого вещества в пламени и излучение света в зависимости от типа присутствующего в веществе элемента

Атомно-абсорбционный спектрометр

ААС

Тепловая атомизация с последующим поглощением света на специфической длине волны

Анализатор термоэнергии

АТЭ

Тепловое разложение и нитрозоаминов с выделением оксида азота, который при реакции с озоном дает хемилюминисценцию

Электрохимический

ЭХД

Поглощение анализируемых веществ потоком жидкости и электрохимическое детектирование их в потоке

Селективный, недеструктивный

Индуктивно связанный плазменно-ионизационный

ДПЭ-ИС

Тепловая атомизация, возбуждение, радиочастотная ионизация, излучение на длине волны, специфической для каждого элемента анализируемого соединения

Плазменно-эмиссионная спектроскопия при постоянным токе

ДПЭ-ПТ

Тепловая атомизация, возбуждение, ионизация постоянным током, излучение света

Термоионный, щелочио-пламенно-ионизационной

ДТИ

Образование и регистрация ионов в водородном пламени в присутствии ионов щелочного металла (Na, Cs, K, Rb)

Селективный к N и Р, деструктивный, ионизационный

Детектор  электролитической проводимости по Холлу

ДЭПХ

Тепловое выделение из анализируемых веществ органических  и  неорганических ионов, определение электрической проводимости растворов ионов

Селективный, деструктивный, неионизационный

Термохимический

ДТХ

Каталитическое разложение анализируемого вещества и регистрация теплового эффекта

Пьезоэлектрический

ДПЭЛ

Избирательная адсорбция анализируемых органических веществ на пьезоэлектрических химических датчиках с применением различных покрытий

 И К-спектрометр

ИКД

Поглощение света в ИК-области анализируемым веществом

 
Практически все детекторы в ГХ могут быть условно разделены на неионизационные и ионизационные. Детекторы также подразделяют на недеструктивные и деструктивные; универсальные и селективные, причем большинство ионизационных детекторов являются селективными и деструктивными, а большинство неионизационных универсальными и недеструктивными.
Как правило, отечественные и зарубежные фирмы, выпускающие газохроматографическую, включают в состав прибора не более пяти-шести детекторов, при чем обычно два-три из них постоянно установлены на хроматографе, а остальные прилагаются в качестве сменных или поставляемых по специальным заявкам. К основным детекторам обычно относятся ДТП, ДП, ДТИ, ДЭЗ, ДПФ, ДФИ. Реже и по специальным заявкам поставляются ДЭПХ, ТЭА, МПД, УФД, ИКД. Приборы физико-химического анализа типа МС, ААС и другие выпускаются отдельно и могут быть использованы в качестве хроматографических детекторов с помощью переходных устройств — интерфейсов. В настоящей главе будут рассмотрены лишь наиболее часто применяемые газохроматографические детекторы: неионизационные (ДТП, ДП, ДТХ ДПФ) и ионизационные (ДПИ, ДЭЗ, ДТИ, ДФИ, МС и др.).

Детекторы по теплопроводности (ДТП)

В настоящее время ДТП различных конструкций широко ис-ользуются в аналитической, препаративной и промышленной ГХ. Применение нагретой проволоки для определения теплопроводности газов относится еще к 1840 г., однако только в начале 20-го века началось детальное исследование этого метода, В 1915 г. Шекспир разработал устройство для измерения теплопроводности газовых смесей и анализа их состава, которое он назвал катаро-метром. Однако временем появления ДТП обычно считают 1933 г., когда была опубликована монография «Газовый анализ путем изменения теплопроводности». Особенно большим изменениям и усовершенствованиям ДТП подверглись с момента опубликова­ния классической работы Димбата, Портера и Стросса в  1956 г.
 
По мере развития ГХ наблюдалось приспособление ДТП ко все более жестким требованиям количественной; хроматографиче-ского анализа. Значительное внимание стало уделяться развитию теории детектирования по теплопроводности.
Следует отметить, что, несмотря на развитие и повсеместное внедрение высокочувствительных ионизационных детекторов, ДТП; не потеряли популярности в хроматографическои практике. Так, в США более 70 % всех газовых хроматографов имеют ДТП. Это связано с преимуществами ДТП, к числу которых относятся следующие:
простота и низкая стоимость как самого детектора, так и элек­тронных блоков к нему;
универсальность (возможность анализа практически любых;веществ;
достаточная чувствительность для многих хронатографических анализов;
высокая
линейность до сравнительно больших концентраций;
хорошая воспроизводимость и стабильность работы и показа­ний.
Обычно ДТП состоит из камеры в металлическом корпусе, через которую продувается поток газа-носителя. Чувствительный элемент детектора (проволочный резистор или
термистор) поме­щается  в центре камеры (чаще всего коаксиально ее стенкам).
При нагреве чувствительного элемента от любого источник, стабилизированного постоянного напряжения возможны четыре вида потерь теплоты (рис. 1а): 
Qтепл — потери теплоты от нагретого элемента к более холо, ной стенке камеры за счет теплопроводности газа-носителя;
Qконв — за счет конвекции газового потока в камере детектора. Свободная конвекция в камерах малого диаметра при относительно небольших расходах газа невелика, и ею можно пренебречь. В этом случае основным источником тепловых потерь являете принудительная конвекция, в результате которой теплота уносите: из ячейки с газом-носителем. В газе-носителе с высокой теплопроводностью теплота передается главным образом за счет теплопроводности. Для газа с низкой теплопроводностью потери теплоты зависят от его теплоемкости. Поэтому вклад принудительной конвекции в теплопотери нагретого элемента ДТП иногда называют «эффектом теплоемкости»;
Qизл — за счет излучения. Интенсивность излучения пропорциональна разности Тэ4 — Tст4, четвертых степеней абсолютных температур нагретого элемента и стенок камеры детектора и возрастает с увеличением этой разности;
Qконц — концевые потери через соединения нагретого элемента с подводящими ток проводами. Эти потери обычно малы, и их не учитывают.
Таким образом, основными источниками тепловых потерь, составляющими 75% теплообмена в ячейке, являются потери, связанные с теплопроводностью и теплоемкостью газа, протекающего через детектор.
Так как абсолютное измерение тепловых потерь от нагретого элемента трудно осуществить, обычно используется разностный метод измерения, причем два чувствительных элемента объединяются в одном блоке. Одна камера, через которую пропускается чистый
газ-носитель, называется сравнительной, а другая, в которую поступает поток газа-носителя из хроматографической колонки, — рабочей. Подобное устройство и является ДТП. Чувствительные элементы ДТП включаются в электрическую мостовую схему (рис. 1б).
 
Рис. 1а. 1 — корпус камеры; 2 — держате­ли чувствительного элемента; 3 — изоляторы; 4 — вход газа-носи­теля: 5 — чувствительный элемент; 6 — выход газа-иосителя.


Рис. 1б. Электрическая мостовая схема ДТП в режиме постоянного напряжения:
1— регистратор; 2 — источник питания; 3 — измеритель тока моста; R1 — чувствительный элемент рабочей камеры детектора; R2 — чувствительный элемент сравнительной камеры; R3, R4 — постоянные    резисторы    (плечи)    мостовой схемы.


В последнее время в сравнительной и рабочей камерах ДТП  устанавливается по два чувствительных элемента или чаще исполь зуются детекторы с двумя сравнительными и двумя рабочим] камерами. Чувствительные элементы ДТП с двумя камерами явля ются двумя плечами мостовой схемы, а детектор обычно называете) двухплечевым; четыре чувствительных элемента являются четырь мя плечами моста, а ДТП  называется четырехплечным. При пропускании чистого газа-носителя через все камеры детектора мост сбалансирован и сигнала нет. Когда выходящая из колонки
проба попадает в рабочую ячейку (или ячейки) детек­тора, теплопроводность смеси (газ-носитель + проба) изменяется. В связи с этим меняется температура чувствительного элемента в рабочей камере, а следовательно, и его сопротивление. Полу­чается разбаланс моста, являющийся сигналом ДТП, который затем регистрируется.
Таким образом, чувствительность ДТП зависит от:
теплопроводностей газа-носителя и смеси газа-носителя с ана­лизируемым веществом;
тока моста, причем с увеличением тока увеличивается чувстви­тельность, но уменьшается стабильность нулевой линии;
температуры чувствительного элемента детектора, так как ее увеличение приводит к увеличению чувстви­тельности детектора;
сопротивления чувствительного элемента;
температуры детектора, так как с ее уменьшением повышается чувствительность;
расхода газа-носителя, поскольку ДТП является типичным концентрационным детектором;
давления в детекторе, причем небольшое увеличение чувстви­тельности ДТП может быть получено путем использования его при пониженном давлении при прочих постоянных рабочих усло­виях. Однако, так как теплопроводность уменьшается с уменьше­нием давления, ДТП не может быть использован при давлениях ниже 3,5 КПа.

 
Рис. 2. Конструкция четырехплечного ДТП с различными камерами: а — проточной;    б — полудиффузионной;    в — диффузионной;   
1 — корпус детектора; 2 — чувствительные элементы; 3 — вход газа-носителя; 4 — выход газа.
По тому, каким образом газ-носитель проходит через ДТП, камеры детектора делят на проточные, диффузионные и проточно-диффузионные (рис. 2). Проточные камеры мало инерционны (
постоянная времени менее 1 с), зато чувствительны к колебаниям расхода газа-носителя. Диффузионные камеры обладают значительно большей инерционностью (постоянная времени может доходить до 20 с), однако практически нечувствительны к изменениям расхода газа через детектор. Проточно-диффузионные камеры имеют промежуточные характеристики.
Корпус ДТП обычно изготовляется из легированной стали, латуни, алюминия и делается массивным для сглаживания колебаний внешней температуры. Корпус детектора для анализа агрессивных веществ изготовляют из никеля или монеля, а иногда из фторопласта (тефлона). В некоторых случаях камеры детектора делаются из стекла. Имеют значение и размеры камер, определяющие рабочий объем детектора. Для аналитических колонок диаметр камер обычно составляет 3...6 мм, а длина 20...60 мм. Для капиллярных колонок большого диаметра (> 0,5 мм) разработаны камеры ДТП диаметром около 1 мм и длиной 20...30 мм. Рабочий объем такого ДТП не превышает 15...20 мкл.
Основное падение температуры происходит недалеко от нагретого чувствительного элемента ДТП (меньше 1 мм от элемента), а увеличение диаметра камеры выше 2 мм почти не влияет на потери теплоты и, следовательно, на чувствительность детектора.

Термисторный детектор по теплопроводности (ДТП-Т)

Разновидностью ДТП является термисториый детектор (ДТП-Т), обладающий способностью к изменению электрического сопротивления с изменением температуры. Чувствительный эле­мент   такого   детектора   представляет   собой   шарик   диаметром  около 0,5 мм из смеси оксидов Мn, Со и Ni со специальными добавками для получения необходимых электрических характе­ристик. Шарики покрыты тонкой стеклянной оболочкой, чтобы сделать их инертными по отношению к окружающей среде. Макси­мальное сопротивление термисторов, используемых в настоящее время, составляет примерно 8 кОм.
Термисторные шарики имеют высокий отрицательный темпе­ратурный коэффициент сопротивления, причем наклон их темпе­ратурных характеристик растет экспоненциально с уменьшением температуры.
Макси­мальная рабочая температура термисторного чувствительного элемента обычно не больше 150 °С, так как выше этой температуры чувствительность детектора резко падает. При низких температу­рах частично за счет увеличения АГ, но главным образом вслед­ствие увеличения сопротивления термистора может быть получена более высокая чувствительность, чем чувствительность литиевого ДТП.
Следует учитывать, что зависимость показаний термистора от тока моста имеет максимум, т. е. существует оптимальная сила тока термистора, которую необходимо поддерживать. В общем случае максимальная чувствительность наблюдается при силе тока моста около 1О...15мА. Следует также иметь в виду, что стеклянное покрытие термисторных шариков может разрушаться. Это приводит к взаимодействию пробы и газа-носителя с термисто-рами, и при использовании, например, водорода в качестве газа-носителя оксиды термистора могут восстанавливаться. Разруше­ние термистора можно выявить путем его осмотра и по дрейфу нулевой линии.
ДТП-Т вследствие малого рабочего объема может применяться с капиллярными и микронасадочными колонками, например, для анализа изотопов кислорода и водорода на стеклянных адсорб­ционных капиллярных колонках. Однако постоянная времени термистора (1...10 с) выше, чем у ДТП, а линейность значительно меньше. В общем случае применять ДТП-Т вместо ДТП не реко­мендуется, кроме некоторых специальных случаев.
Чувствительность ДТП-Т, работающего при 0 оС и ниже, на несколько порядков выше, чем его чувствительность, например, при 30 °С. Это свойство термисторов особенно важно для анализа газов при низких температурах.
Таким образом, для термисторного детектора необходимо учитывать следующее:
электрические характеристики детектора таковы, что дают максимальную чувствительность при определенном токе моста, больший или меньший ток вызывают уменьшение сигнала;
обычно максимальная чувствительность (примерно такая же, что и чувствительность ДТП) наблюдается при силе тока моста около 10 мА;
чувствительность детектора с уменьшением температуры увели­чивается, при высоких температурах анализа (больше 150 °С) чувствительность детектора резко падает;
для   ДТП-Т   особенно   необходимо   соблюдать   рекомендации фирмы, выпускающей детектор 
Преимуществами ДТП-Т являются: малый рабочий объем де­тектора; большое начальное сопротивление чувствительного эле­мента; высокий температурный коэффициент сопротивления; воз­можность работы при небольших токах моста и в связи с этим применение маломощных источников питания.
Недостатки термисторного детектора следующие: более высо­кая, чем у ДТП, инерционность; уменьшение чувствительности с увеличением температуры в детекторе; меньшая, чем у ДТП, линейность.

Детектирование по теплопроводности с конверсией (ДТП-К)

ДТП применяется при анализе органических соединений путем конверсии определяемых веществ на катализаторах с последующим детектированием продуктов конверсии. Обычно между колонкой и ДТП помещается трубка с катализатором. Этот метод приме­няется в целях повышения чувствительности ДТП и упрощения калибровки, которая проводится только для СО2, Н2 или СН4. Сигнал детектора становится пропорциональным числу атомов углерода или водорода в молекуле и не зависит от теплопровод­ности исходного анализируемого вещества.
Конверсия до СО2 проводится в трубчатой печи на катализаторе (обычно оксид меди) при температуре 750...800°С. Органические соединения окисляются до СО2 и Н2О. Вода удаляется в осушающей трубке, а СО2 с потоком газа-носителя (Не) попадает в ДТП.
Конверсия до Н2 проводится в трубках с оксидом меди и восста­новленным железом. Получающаяся вода разлагается на Н2 и О2; СО2 поглощается в трубке с аскаритом, а Н2 детектируется с при­менением газа-носителя азота.
Конверсия до СН4 проводится в потоке газа-носителя (Н2), который пропускается перед вводом в детектор через никелевый катализатор. Происходит гидрирование органических соединений до СН4 с последующим определением СН4 на ДТП.
Недостатком детектирования с конверсией являются большие постоянные времени и увеличение мертвого объема детектирования, которое вызывает дополнительное размывание пика.
Предложен полупроводниковый детектор (А. с. 238871 СССР, МКИ G01 N 31/08), на ЧЭ которого нанесена пленка ZnO толщи­ной 0,2 мкм, при этом на поверхности ЧЭ при температуре около 550 °С осуществляется каталитическая реакция взаимодействия анализируемого вещества с кислородом, содержащимся в газе-носителе. При использовании смесей Не + 10-4% О2, N2 +0,5% О2 или воздуха в качестве газов-носителей чувствитель­ность детектора к ацетону составляет  10-5%  (объемных).

Термохимический детектор

Принцип действия термохимического детектора (ДТХ) основан На измерении теплового эффекта каталитического сжигания пробы На поверхности платиновой нити. В качестве ячейки для каталитического сжигания может служить обычная камера ДТП с платиновым чувствительным элементом; газ-носитель — воздух. Наиболее  распространенной   является   конструкция   ДТХ,   в   которой платиновая спираль с проволокой диаметром около 30 мкм запрес­совывается в шарик из Al2O3 диаметром около 1 мм. Сопротивление такого чувствительного элемента около 10 Ом. Поверхность ша­рика  покрывается  Pt—Pd-катализатором.  Рабочая  температура 400...500°С.   Выделяющаяся   при   сжигании   теплота   повышает температуру нити и, следовательно, ее сопротивление. Изменение сопротивления  нити,  пропорциональное  концентрации   анализи­руемого  вещества,  фиксируется   с  помощью  обычной  мостовой схемы.
Перепад температуры между стенкой и чувствительным элеметом в ДТХ не играет роли. Достаточно нагреть чувствительнь элемент   до   необходимой температуры,   чтобы   осуществляло каталитическое сгорание анализируемой смеси. ДТХ применяв для анализа только горючих веществ, причем его чувствительное к этим соединениям выше, чем чувствительность ДТП, так как тепловой   эффект   каталитического   сгорания   пробы   достаточна велик.
Для детектирования  метана  необходимо  учитывать,  что  ег каталитическое окисление происходит при более высокой темпера туре, чем других углеводородов. В случае применения в качестщ газов-носителей гелия и водорода ДТХ может работать как обь ный ДТП, правда, со значительно меньшей чувствительности. Чувствительность, например, ДТХ хроматографа «Газохром 3101 завода  «Хроматограф»   (г.Москва)   составляет  5*10-4% по CH4 и 1*10-3% по СО. Недостатком детектора является постепенное уменьшение каталитической активности платиновых чувствительных   элементов.   Поэтому   требуется   периодическая замена элементов и связанная с этим перекалибровка детектора.

Пламенно-фотометрический детектор (ДПФ)

Пламенно-фотометрический детектор (ДПФ) известен уже более 20 лет. Впервые он был предложен в 1962 г. для обнаружения серо- и фосфорсодержащих соединений в воздухе. В 1966 г. был создан первый ДПФ специально для газовой хроматографии. В связи с высокой чувствительностью ДПФ при детектировании серо- и фосфорсодержащих соединений он широко применяется в хроматографической практике и серийно выпускается большинством ведущих в области хроматографического приборостроения фирм.

Принцип действия ДПФ основан на возбуждении анализируемых соединений в обогащенном по водороду пламени. При возвращении возбужденных молекул в основное состояние возникает эмиссия света на определенной длине волны, характерной для Данного соединения. Интенсивность света характеристической длины волны является количественной мерой испускающего его соединения. Свет регистрируется фотоумножителем, который вы дает сигнал в виде хроматографического пика.

Основное применение ДПФ нашел для анализа серосодержащих . органических и неорганических соединений. В связи с тем, что ДЭЗ и ДТИ обладают более высокой чувствительностью к фосфор содержащим соединяющим, они составляют конкуренцию ДПФ при анализе этих соединений. Несмотря на то, что ДПФ селективен главным образом к соединениям, содержащим серу и фосфор, он является достаточно чувствительным и селективным к галогенам, азоту, бору, таким металлам, как олово, хром, селен и германий. ДПФ был также использован для анализа алифатических вторичных аминов и их производных.

Такие соединения, как СО, СО2, N2О4, SO2, N2F4, HF, CS2, H2S, которые практически нельзя определить с помощью ДПИ, анализируются на ДПФ с высокой чувствительностью.

Известно, что пламя в ДПФ выполняет три функции: в горячей зоне пламени исходные соединения, содержащие серу,  разлагаются; из продуктов разложения прямо или косвенно выделяются атомы серы; в более холодной зоне пламени образуются возбужденные молекулы серы.

Предел детектирования для соединений, содержащих фосфор, обычно составляет около 1*10-13 г/с по фосфору.

К галогенсодержащим соединениям предел детектирования составляет 10-6 ... 10-13 моль. Измерение SO2 и H2S в воздухе можно проводить на уровне < 0,1 млн-1.

Одним из новых направлений развития ДПФ является повышение его чувствительности к металлорганическим соединения: путем введения в пламя ДПФ предварительно очищенных фторо) кварцевой ваты или кварцевого стержня. Наблюдаемая поверхностная люминесценция, например, при детектировании органических соединений олова (эмиссия в области 390 нм) и при температуре ДПФ не менее 200...300°С дает возможность получить один из самых чувствительных методов детектирования в хроматографии. Предел детектирования по олову составляет 5*10-16 г/с или 4*10-18 моль/с. Недостатком детектора является отравление поверхности кварца с течением времени. Присутствие фтора в анализируемом соединении увеличивает стабильность работы детектора и его время жизни.

При  работе с ДПФ следует иметь в виду,  что присутствие летучих   органических   соединений   в   газе-носителе   или   пробе снижает   чувствительность   однопламенных   детекторов,   причем . Чувствительность падает экспоненциально с ростом концентрации мешающих  примесей. Такое резкое уменьшение чувствительности можно объяснить деактивацией возбужденных молекул при их рекомбинации или столкновении с органическими соединениями и продуктами их разложения, причем эмиссия S2 уменьшается по всему диапазону длин волн от 300 до 400 нм. Одной из трудностей при работе с однопламенным ДПФ является возможность гашения пламени при вводе жидких проб анализируемых веществ в растворителе объемом более  1  мкл.

Для устранения этих нежелательных эффектов был предложен двухпламенный ДПФ. Сгорание всей массы пробы вместе с растворителем и парами органических загрязнителей происходит в нижнем, относительно обогащенном кислородом пламени, а регистрация сигнала эмиссии осуществляется над верхним относительно обедненным кислородом пламенем.

 Чувствительность ДПФ зависит от интенсивности эмиссии света, связанной с хемилюминесценцией. Интенсивность эмиссии увеличивается с уменьшением температуры пламени и увеличением количества водорода в диффузионном пламени относительно содержания воздуха и газа-носителя (N2). Температура пламени уменьшается с относительным уменьшением массы горючих газов и увеличением теплопроводности газа-носителя (Н2 или Не по сравнению с N2). Если расходы горючих газов уменьшаются, фоновый ток и уровень шумов ДПФ также уменьшаются, при этом отношение сигнала к шуму становится больше. Показания ДПФ примерно пропорциональны концентрации Н2 в третьей степени. По этой причине обычно работают при высоких концентрациях Н2 и точном контроле расходов газов. Максимальная концентрация Н2 лимитируется нестабильностью пламени, которое может погаснуть при выходе пиков  растворителя  или основных компонентов.

При использовании Н2 в качестве газа-носителя важно поддерживать его поток постоянным в целях уменьшения погрешности количественных измерений. Однако Не предпочтительнее в качестве газа-носителя по сравнению с Н2.

Так как температура ДПФ влияет на фоновый ток и уровень шумов, очень важно поддерживать ее постоянной. Диапазон линейности ДПФ мал, поэтому его необходимо экспериментально определять для различных конструкций детектора, которая  может быть различной. В целях повышения чувствительности ДПФ к серосодержащим соединениям иногда в водородное пламя добавляют SO2 или другие содержащие серу газы.

Возможности снижения уровня шумов ДПФ сильно ограничены значительным влиянием пламени на шум. Например, доля уровня шумов от пламени эквивалентна сигналу, полученному при концентрации SO2, равной 5 млрд-1.

На основе сказанного выше может быть сделан вывод, что достигнутые к настоящему времени пределы детектирования для ДПФ близки к теоретическим, поэтому должны быть созданы новые конструкции детекторов или предложены новые принципы эмиссионного детектирования. Одним из возможных путей в разработке ДПФ нового поколения может быть создание беспламенных детекторов.

Пламенно-ионизационный детектор (ДПИ)

В настоящее время пла менно-ионизационный детектор (ДПИ) является одним из наиболее распространенных и популярных детекторов в ГХ. Впервые он был предложен и описан в 1958 г. С тех пор этот детектор по всем характеристикам не был превзойден ни одним из вновь предложенных детекторов.

 ДПИ  обладает  высокой  чувствительностью  и   имеет  пре детектирования примерно того же порядка, что и все остальные; ионизационные детекторы. ДПИ имеет чрезвычайно высокий линейный динамический диапазон (до  107), что дает ему ряд преимуществ  при  проведении  количественных   анализов.  Детектор прост по конструкции, обладает малым рабочим объемом и малой инерционностью. Он широко применяется с капиллярными и микронасадочными колонками. ДПИ малочувствителен  к колебаниям расхода газа-носителя, давления и температуры,  поэтому его с успехом используют при  анализах с программированием температуры в колонке.

ДПИ чувствителен к большинству органических соединений. Детектор  практически  не чувствителен  к воде в  газе-носителе и в пробе, в связи с чем его достаточно широко используют при анализе проб, содержащих воду, в том числе проб окружающей, среды.  


 

 

Рис. 3 Схема дифференциального ДПИ: а — с одним усилителем; б — с двумя усилителями или одним дифференциальным усилителем; i1 и i2 — ионизационные токи.

Схемы,   поясняющие   принцип   действия   дифференциальной ДПИ, приведены на рис. 3. В детекторе устанавливается источник ионизации, которым в данном случае является горящее водородное пламя, воздействующее на пробу, выходящую из хромато-графической  колонки  и  попадающую вместе с газом-носителем в пламя. В детекторе имеются два электрода — потенциальный 1, в качестве которого часто используется  горелка,  и коллекторный 2.  К первому электроду прикладывается  напряжение для сбора  ионов,  со второго снимается сигнал детектора.  Разность ионизационных   токов   i1 — i2 = Iф   является   фоновым   током.

Водородное пламя, горящее в воздухе или кислороде, всегда генерирует ионы. Однако при попадании в пламя анализируемого вещества (особенно углеродсодержащего соединения), скорость образования ионов и их количество сильно увеличиваются. В  результате возникает ток  сигнала детектора.

 Установлена значительная зависимость характеристик ДПИ от структуры водородного пламени. В диффузионном пламени эффективность ионизации возрастает до насыщения с увеличением количества кислорода в пламени; в гомогенном пламени эта за висимость имеет максимум при содержании кислорода, близком к стехиометрическому. Эти зависимости были объяснены различием в процессах термодеструкции в восстановительной и окислительной средах. Было показано, что гомогенное пламя не подходит для хроматографических целей и что напряженность электрического поля в детекторе не влияет на процесс образования заряженных частиц, а определяет только полноту их сбора.

На фоновый ток ДПИ оказывают влияние термическая ионизания газов, наличие примесей органических веществ в водороде, воздухе и газе-носителе, паров неподвижной фазы в газе-носителе, а также термоионная эмиссия с поверхности электродов. Постоянная времени самого ДПИ составляет около 10-3 с и определяется главным образом инерционностью применяемых усилителей   и   регистраторов. Все ДПИ содержат следующие общие конструктивные элементы: корпус, горелку, электроды, изоляторы, вводы воздуха, водорода и газа-носителя, спираль для поджигания пламени. Корпус детектора обычно представляет собой металлический цилиндр, который должен разбираться таким образом, чтобы был удобный доступ к электродам и горелке детектора.Горелку ДПИ обычно изготовляют из антикоррозионной стали, никеля или кварца. К материалу горелки предъявляется три требования: он должен быть термически и химически стабилен и не должен плавиться при температуре водородного пламени, Форма пламени имеет большое значение для работы ДПИ. Должно выдерживаться определенное соотношение между расходами во дорода, газа-носителя и диаметром сопла горелки. Поэтому при работе с заполненными колонками и при расходе газа-носителя около 30 ... 50 см3/мин диаметр сопла обычно делают около 0,5 ... 0,8 мм. Для капиллярных колонок применяются горелки с выходным отверстием около 0,3 мм. Некоторые фирмы прилагают набор горелок с отверстиями различных диаметров. Электроды детектора  для  увеличения их термической и  химической  стабильности обычно изготовляют полированными из никеля или антикоррозионной   стали.

Существуют две различные конструкции ДПИ (рис. 4):

с двумя электродами, причем потенциальным электродом является горелка (рис. 4, а). В этом случае горелка делается металлической,   а   собирающий  электрод  цилиндрическим;

с двумя электродами и так называемой «плавающей» горелкой (рис. 4, б). Горелка может быть изготовлена из кварца. Металлическая горелка в этом случае обычно заземляется.


Рис. 4. Схемы ДПИ с горелкой в качестве электрода и с двумя электродами:  1,4— электроды; 2 — водородное пламя; 3 — горелка.

Расстояние между электродами определяется размером пламени и влияет на чувствительность, уровень шумов и напряжение питания.

ДПИ может применяться при достаточно высоких температурах (например, выше 500 °С), причем наиболее жесткие требования предъявляются к изоляторам электродов. Поэтому чаще всего применяют изоляторы из керамики, которые могут быть размещены в достаточно горячей части детектора. Иногда изоляторы предохраняют от контакта с потоком газа-носителя и пробы из колонки и с продуктами их сгорания. Такие меры позволяют работать с ДПИ длительное время без его очистки и ухудшения характеристик. Применяются также меры для дополнительного охлаждения изоляторов путем выноса их в холодную зону или обдува  потоком газа.

Важно отметить недопустимость термоионной эмиссии с металлической поверхности отрицательного электрода. Поэтому необходимо, чтобы отрицательный электрод не раскалялся в пламени.

Расстояние между электродами не имеет большого значения. Оно влияет на напряжение, соответствующее току насыщения. Например, при  обычно применяемых расстояниях 10 ... 12  мм. может потребоваться напряжение 40 ... 180 В. При расстоянии выше 15 мм увеличивается уровень шумов.

В ДПИ в основном применяются три газа: газ-носитель, водород и воздух. В качестве газа-носителя чаще всего используют азот и иногда водород или гелий. Водород или воздух  необходимы  для  горения  пламени.

Ко  всем  газам  предъявляются  следующие требования:

в газах не должно содержаться примесей органических веществ и  солей  щелочных  металлов;

в газах не должно быть пыли, которая приводит к нестабиль ности горения пламени, вызывая резкое увеличение шумов де тектора;

для получения нужной температуры пламени необходимо правильное долевое соотношение азота, водорода и воздуха. Недостаток воздуха приводит к неполному сгоранию и уменьше нию чувствительности. Большой избыток воздуха увеличивает шумы детектора в связи с появлением турбулентности потока.

Небольшое количество влаги в газах не оказывает сильного влияния на работу ДПИ.

При работе ДПИ в промышленных хроматографах должны быть приняты меры по взрывобезопасности детектора. Для этой цели предложено выходной патрубок ДПИ заполнять мелким песком или другим инертным сыпучим материалом.

Для поджигания пламени в ДПИ на уровне сопла горелки или выше устанавливается небольшая спираль, нагреваемая электрическим током. Выше или рядом с пламенем иногда помещается термопара, контролирующая наличие пламени. В этом случае может быть реализована система автоматического поджигания пламени при охлаждении термопары.

В ряде конструкций ДПИ предусмотрен автоматический поджог пламени при неоднократном его угасании,  и если пламя не поджигается, выключается подача водорода. Иногда перед поджигом пламени автоматически вдвое увели чивается расход Н2, и после поджига расход также автоматически устанавливается на прежнем значении. В случае, если пламя не загорелось, производится автоматический поджог до 3 раз, после чего фиксируется аварийное состояние хроматографа. Контроль за наличием пламени осуществляется по фоновому току ДПИ. Визуальный контроль за пламенем проводится по зеркальной поверхности. При поднесении палочки с зеркалом на конце к вы ходу детектора с горящим пламенем на зеркале появляются капельки воды.

В связи с широким использованием в ГХ программирования температуры чаще всего применяются ДПИ с двумя идентичными колонками при строго одинаковых экспериментальных пара метрах как колонки, так и детектора. Это позволяет устранить влияние на фоновый ток детектора колебаний расхода газа-носителя и температуры, связанных с загрязнением газа-носителя и улетом неподвижной фазы из колонки. Кроме того, такое применение позволяет значительно снизить дрейф нулевой линии и улучшить стабильность работы детекторов. В этом случае один из детекторов, в который поступает анализируемая проба, является  рабочим,  а другой—сравнительным.

Для повышения стабильности и надежности работы ДПИ предложено использовать горелки, соединенные со смесительной камерой, к которой подведены конец хроматографической колонки и ввод водорода (рис. 5). Горелки изготовлены из керамики и имеют два металлизированных сопла, одно из которых является измерительным, а другое служит потенциальным электродом. Ось симметрии горелок совпадает с осью корпуса детектора.


 

Рис. 5. ДПИ с двумя горелками:

1 — потенциальный электрод;  2 — изоляторы;   3 — система поджога;   4 — корпус;   5  - выход газов; 6 — пламя;  7 — коллекторный электрод; 8 — основание; 9 — уплотнение; 10 — колонка; 11 — кварцевые горелки;   12— наконечники горелок

Рис. 6. Линейные   области   детектирования   различных   детекторов  ДЭЗп - питание постоянным током; ДЭЗи — импульсное питание.

Для использования ДПИ с кварцевыми капиллярными колонками (ККК) в высокоэффективной капиллярной ГХ необходимо провести модификацию конструкции и оптимизацию его параметров. При этом оптимизируются расходы горючих и вспомогательных газов, диаметр сопла горелки, расстояние между электродами, напряжение питания, постоянная времени. Получены, например, следующие значения оптимизированных пара метров для ДПИ с ККК: уровень шумов 1 *10-14 А; постоянная времени 50 мс, напряжение питания 180 В, диаметр сопла 0,15 мм, расстояние от конца горелки до коллектора 2,5 мм, расходы азота 20 см3/мин водорода 24 см3/мин, диапазон линейности от 300 нг до 30 пг для гексадекана; чувствительность 20 мКл/г (С). ДПИ  может быть использован для селективного детектирования металлоорганических соединений, для чего к водороду добавляют небольшое количество силана и смешивают его перед горелкой с кислородом в соотношении 1:1. Пламя горит в атмосфере водорода. С помощью МС установлено, что при сгорании органических соединений в пламени образуются гидратированные протоны (Н2О)nН+. Для обычных органических и металлорганических соединений средние молекулярные массы таких комплексов равны 38 и 62 соответственно. Менее подвижные ионы более эффективно собираются на коллекторном электроде, расположенном в нескольких сантиметрах над пламенем. Селективность к металлорганическим веществам по сравнению с углеводородами составляет 105 ... 106.  Предел детектирования  равен   10-15 моль.

ДПИ является одним из наиболее линейных детекторов в (рис. 6).  По различным оценкам диапазон его линейности  составляет 106 ... 107. Как показали исследования работы ДПИ для летучих углеводородов С1—С6 с использованием в качестве газов-носителей Не, N2, Ar и их смесей, для повышения линейности ДПИ в области больших концентраций следует учитывать полученные методом экспоненциального разбавления поправочные  коэффициенты.

Существуют два варианта включения ДПИ:

1)        включение по схеме вычитания с одним усилителем и двумя источниками питания. В этом случае применяется обычный усилитель, на который подается только разностный сигнал ток двух детекторов;

2)        схема с двумя усилителями, включенными по схеме вычитания, и двумя источниками питания.

Чувствительность ДПИ пропорциональна содержанию атом углерода в исследуемом веществе.

Так как чувствительность ДПИ зависит от температуры пламени, необходимо поддерживать постоянными расход водорода и соотношение между количеством водорода и газа-носителя. ДПИ—типичный потоковый детектор, поэтому его показания (площадь пика) не зависят от расхода газа-носителя и определяются количеством вещества, поступающего в детектор в единицу времени (например, в г/с). Однако, так как состав газов в пламени зависит от расхода газа-носителя, чувствительность все же может незначительно изменяться.

ДПИ нечувствителен к целому ряду соединений, включая постоянные газы. Поэтому ДПИ не может быть использован для анализа, например, таких соединений, как: CO2, CS2, SO2, NO, NO2, H2S, N2O, CO, CO2, H2O, SiCl4, NH3, HCOOH, (COOH)2, SiF4 и др. Следует особо отметить, что ДПИ не только не дает показаний по перечисленным выше соединениям, но его чувствительность к другим  соединениям не изменяется в их присутствии, если концентрации этих соединений не настолько большие, чтобы изменить состав пламени. Это свойство отличает ДПИ от большинства других ионизационных детекторов и дает ему неоспоримые преимущества, особенно при обнаружении загрязнений в воздухе и анализе водных смесей, таких как спиртные напитки, биологические и пищевые экстракты.

В связи с нечувствительностью ДПИ к большинству газов эти газы и их смеси могут быть использованы в качестве газов-носителей в некоторых специальных случаях. Например, СО2, используемый в качестве газа-носителя при анализе жирных кислот, уменьшает хвосты пиков и увеличивает их удерживаемые объемы. Пары Н2О уменьшают хвосты при анализе свободных жирных кислот. Добавление аммиака улучшает разделение эфиров аминокислот, в которых имеются свободные аминогруппы. ДПИ можно также применять для анализа следов некоторых негорючих соединений (СО, Н2О, СО2) путем пропускания газа-носителя перед вводом в детектор через дополнительную колонку с катализатором. Например, СО и СО2 восстанавливаются водородом на никелевом катализаторе до СН4, а Н2О при реакции с карбидом кальция переходит в С2Н2.

Среди других характеристик ДПИ можно отметить следующие: высокое быстродействие (малая постоянная времени); не большой рабочий объем (возможность применения с капиллярными колонками); максимальная температура использования до 600 °С; дешевый газ-носитель (N2); сравнительно низкая стоимость детектора.

Недостатками ДПИ являются: нечувствительность к ряду соединений; деструктивность; взрывоопасность (в связи с при менением Н2);   необходимость электрометрического усилителя.

Соблюдение правил работы с ДПИ позволяет получать данные, трудно достижимые с помощью детекторов других типов.

Детекторы для жидкостной хроматографии

 

 

Наиболее существенным в развитии хроматографического приборостроения,  за последнее время, является стремительное расширение разработок и выпуска жидкостных хроматографов при дальнейшем совершенствовании и устойчивом увеличении выпуска газовых хроматографов.

Все более популярным становится метод высокоэффективной ЖХ (ВЭЖХ), причем развитие метода происходит значительно быстрее, чем предшествующее развитие метода ГХ. Это связано со следующими причинами. Анализ на основе метода ВЭЖХ может быть экспрессионным (10—12-компонентиая смесь анализируется в среднем за 10 ... 15 мин или быстрее); чувствительность метода достигает 10-9 ... 10-10 г/мл (в пределе до 10-12 г/мл); объем вводимых проб составляет не более 10 ... 100 мкл; метод экономичен.

Основные типы детекторов для ЖХ

 

Фотометрические детекторы

Ультрафиолетовый детектор

Рефрактометрический детектор

Интерферометрический детектор

Флуориметрический детектор

Электрохимические детекторы

Вольтамперометрический детектор

Потенциометрический детектор

Полярографический детектор

Кулонометрический детектор

Детектор радиоактивности

Детектор по светорассеиванию
 

В ходе развития ЖХ было предложено большое количество методов детектирования. Существует уже более 20 типов детекторов для ЖХ. Классификация показывает, что основную массу предложенных детекторов можно разложить на следующие классы: оптические, электрические, электрохимические и детекторы для измерения радиоактивных веществ.

К оптическим детекторам относятся ультрафиолетовый (УФД), инфракрасный (ИКД), рефрактометрический (РМД) и флуорометрический (ФМД), а также все детекторы, в которых в той или иной мере используется лазерное излучение, такие как детектор светового рассеяния (СРД), фотоакустический (ФАД), фотокалориметрический (ФКД), фотоионизационный (ФИД) и поляризационный (ПОД) детекторы.

К электрическим детекторам обычно относят детектор по диэлектрической постоянной (ДПД), акустический (АД), емкостный (ЕМД), детектор тока потока (ТПД) и некоторые другие.

Отдельно рассматривается использование в качестве детекторов для ЖХ различных приборов физико-химического анализа, таких как масс-спектрометр (МС), атомноабсорбционный спектрометр (ААС), поляриметр (ПОД), УФ-, ВИД- и ИК-спектрофотометры и газохроматографических детекторов, таких как ДЭЗ, ДПИ, ДПФ, ДТИ и др. 

Тип

Предел детектирования, г/мл

ЭХД

10-12

ФМД

10-11

УФД

10-10

СПФ

10-9

МС

ЭПД

10-7

РМД

Наиболее распространенными детекторами в ЖХ являются оптические детекторы, которые можно разделить на следующие классы:

абсорбционные,  работающие в  УФ-области  спектра  (190 ... 380 нм), — УФД.

абсорбционные для видимой области спектра (380 ... 800 мм) -ВИД;

ИК-детекторы (800 ... 5000 нм) — ИКД;

рефрактометрические различных типов — РМД;

эмиссионные, флуориметрические различных конструкций — ФМД;

хемилюминесцентные — ХЛД.

 

Фотометрические детекторы

  Наиболее часто в ЖХ применяются фотометрические детек торы, основанные на измерении поглощения (абсорбции) света в УФ- или видимой областях спектра. Это связано с тем, что большинство химических соединений имеют достаточно ин тенсивные полосы поглощения в диапазоне длин волн 200 ... 800 нм. Наличие подходящих растворителей, прозрачных в этом диапазоне длин волн, делает фотометрические методы наиболее подходящими для градиентного элюирования.

Фотометрические детекторы имеют достаточно высокую чувствительность для поглощающих УФ- и видимый свет веществ, высокий динамический диапазон линейности (до 106), малый рабочий объем ячеек (<1 мкл), небольшое экстраколоночное расширение пиков и высокую воспроизводимость показаний. Они являются недеструктивными и относительно нечувствительными к колебаниям потока подвижной фазы и изменениям температуры, достаточно удобны в работе и обеспечивают возможность выбора длин волн.

Ультрафиолетовый детектор

Чувствительность современных УФД может доходить до 0,001 е. о. п. на всю шкалу при  1 % шума и зависит от природы анализируемого соединения и длины волны детектирования этого соединения. При такой высокой чувствительности могут быть зафиксированы малые количества (до нескольких нанограммов) слабо абсорбирующих УФ-свет веществ. Широкая линейная область УФД позволяет анализировать как примеси, так и основные компоненты на одной  хроматограмме.

Фотометрические детекторы в свою очередь подразделяются на детекторы с фиксированной длиной волны (УФД), детекторы со сменной (с помощью фильтров) длиной волны, или фильтровые фотометры (ФУФД), и спектрофотометрические детекторы с детектированием в определенной области длин волн (СПФ).

Наиболее простые и дешевые УФД широко применяются в высокоэффективных жидкостных хроматографах, особенно в при борах, предназначенных для массовых рутинных анализов.

При использовании Hg-лампы низкого давления, обладающей высокой стабильностью и долгим временем жизни (более 5000 ч), детектирование проводится на длине волны 254 нм, которой соответствует  90%  энергии излучения. На длине волны254 нм высоким поглощением обладают многие органические соединения, такие как ароматические, гетероциклические, кетоны и т.п.

Наиболее часто для УФД применяются ячейки следующих размеров: длина оптического пути 10 мм, диаметр светового канала около 1 мм, рабочий объем ячейки около 8 мкл. Такие ячейки подходят главным образом для аналитических колонн внутренним диаметром 4 ... 6 мм, заполненных сорбентом с частицами около 5 мкм. Рабочий объем ячейки — это один из важнейших ее параметров. Например, использование ячейки объемом 8 ... 10 мкл может привести к дополнительному размыванию пика на 30 ... 50 мкл и может оказаться неприемлемым для пиков шириной менее 100 мкл. Уменьшение объема ячейки может быть достигнуто двумя путями: сокращением длины оптического пути, что приводит к падению чувствительности детектора, и уменьшением диаметра канала ячейки, которое приводит к снижению интенсивности проходящего через нее света и увеличению шума. Оба эти эффекта увеличивают предел детектирования. Для сверхкритической флюидной хроматографии (СКФХ) необходимы проточные ячейки высокого давления. Оптические детекторы в целях компенсации фона чаще всего имеют две ячейки: рабочую и сравнительную. Для двухканального детектирования используются следующие методы, подключения сравнительных ячеек:

статический при заполнении  сравнительной ячейки чистым растворителем;

динамический путем разделения потока от насоса на две части и пропускания одного из них через рабочую, а другого — через сравнительную колонку и сравнительную ячейку;

динамический с использованием дополнительного насоса низкого давления для прокачивания ячейки тем же растворителем;

динамический путем включения сравнительной ячейки между сосудом с растворителем и насосом в зоне всасывания, а рабочей ячейки — после разделительной колонки.

Спектральный диапазон и степень его разделения на поддиапазоны зависит от спектральной характеристики источника из лучения и от способа выделения необходимой спектральной полосы, осуществляемого или до измерительной ячейки или после нее. Некоторые источники излучения имеют линейчатый спектр (например, ртутная лампа — 254; 303; 313; 365; 464; 436; 516 нм и т.д.), другие — непрерывный спектр (например, дейтериевая лампа — 190 ... 600 нм). Интенсивности их излучения в пределах рабочего диапазона приблизительно одинаковы. Необходимая спектральная полоса выделяется двумя различными способами: с помощью дифракционных решеток, имеющих 1000 ... 3000 штрихов на 1 мм, и интерференционных фильтров с заданной шириной спектральной полосы. В обоих случаях может быть получена спектральная полуширина от 1 ... 2 нм до 10 ... 20 нм.

Способ дискретизации спектрального диапазона в фотометрических детекторах определяет различие между спектрофотометрами и фильтровыми фотометрами для ЖХ.

Следует иметь в виду, что СПФ, обеспечивающие возможность многоволнового детектирования, очень дороги. Для дешевых приборов массового анализа необходимо сочетать возможность работы на нескольких длинах волн с низкой стоимостью детектора, что обеспечивается применением фильтрового фотометра.

Характерной особенностью многих фильтровых УФД является использование в них источников линейчатого спектра. Кроме ртутной применяются кадмиевая и цинковая лампы с линиями на 229 и 214 нм соответственно. Используются также преобразователи излучения с длиной волны λ = 254 нм в излучение с λ = 280 ... 290 нм и в другие длины волн, отсутствующими в спектре ртути.

Особый интерес представляют разработанные в последнее время фильтровые фотометры с дейтериевой лампой в качестве источника излучения. В них используется принцип выделения в УФ-области спектра достаточно широких полос (около 10 нм) из непрерывного спектра источника с помощью широкополосных интерференционных фильтров. Этот принцип применяется также в флуориметрии и спектроскопии в видимой области. Характеристики таких фотометров достаточно высоки. Выводы о более высоком уровне шумов при использовании фильтровых УФД по сравнению с шумами приборов с источниками линейчатых спектров справедливы в случае узкополосных интерференционных фильтров, так как доля энергии,-приходящаяся на узкую (1 ... 2нм) полосу непрерывного спектра, значительно ниже энергии наиболее интенсивных полос, например, ртутной лампы.

Применение широкополосных фильтров позволяет получить примерно на порядок более интенсивный световой поток. Уровень шумов значительно снижается. Достигается перекрытие достаточно широкого диапазона длин волн с помощью всего 4 ... 6 интерференционных фильтров. При этом наблюдается некоторое снижение селективности детектирования по сравнению с селективностью СПФ, но, учитывая большую ширину полос (30 ... 40 нм), характерную для электронных спектров поглощения молекул, этот эффект можно не учитывать.

При сравнении фильтровых фотометров с СПФ низкого разрешения предпочтение также отдается первым вследствие простоты их оптической схемы без множества отражающих поверхностей, существенно ослабляющих световой  поток в СПФ.

В настоящее время наблюдается тенденция использования фильтровых фотометров для многоволновой записи хроматограмм — метода, который ранее считался областью применения только дорогостоящих сканирующих спектрофотометров.

Учитывая изложенное выше, можно заключить, что применение УФД с дейтериевой лампой в качестве источника света и набором широкополосных фильтров с целью создания относительно дешевого двух-, трех- и четрехволнового УФД с выбором длин волн в диапазоне 200 ... 300 нм является самым распространенном.


 

Рис. 1. Оптическая схема двухканального УФД с фотодиодной матрицей:

1 — источник света; 2 — щелевая линза; 3 — проточная ячейка; 4 — щель; 5 — решетка; 6 — зеркало; 7 — фотодиодная матрица; 8 — селектор длин волн; 9 — дифференциальный   усилитель;   10 — самопишущий   прибор.

Другим перспективным направлением является применение фотодиодных матриц для регистрации всего спектра (Рис. 1). В СПФ с фотодиодной матрицей непрерывное излучение источника света проходит через проточную ячейку 3 и попадает на дифракционную решетку 5. Луч отклоняется и фокусируется на плоскости фотодиодной матрицы 7, состоящей из 200...500 элементарных фотодиодов, которая выдает информацию сразу обо всем диапазоне длин волн с дискретностью 2...5 нм. Постоянная времени системы с 200 фотодиодными элементами должна быть не более 40 нс. В связи с тем, что при регистрации спектра в диапазоне длин волн 200...600нм создается массив информации около 1000 К для аналитической хроматографии и около 5000 К для микроколоночной ВЭЖХ при ширине пика на половине высоты менее 1 с, обработка и запись спектров проводится с помощью быстродействующих компьютера и регистратора.

 Совместное использование детекторов нескольких типов в единой системе, например УФД с инфракрасным (ИКД) и рефрактометрическим (РМД) детекторами, значительно увеличивает информативность анализа в результате одного разделения, особенно при идентификации таких соединений, как насыщенные, ненасыщенные, разветвленные и ароматические углеводороды. Примером может также служить применение управляемого компьютером градиентного жидкостного хроматографа с УФД, ФМД и когерентным рамановским спектрометром в качестве детектора, объединенными в единую систему около одной ЭВМ.

К фотометрическим детекторам относится также детектор, основанный на поглощении света в ИК-области спектра (ИКД). Некоторые функциональные группы органических соединений имеют характеристические частоты в ИК-спектрах этих соединений. Поэтому ИКД может служить для идентификации природы органических соединений. Одним из основных условий работы ИКД является  прозрачность применяемых растворителей в ИК-области спектра. Наиболее подходящими, однако редко применяемыми в хроматографической практике, растворителями являются ССl4, СНСl3 и CS2.

Абсорбция ИК-света может быть использована как для селективного, так и неселективного детектирования.  Если ранее детекторы этого типа применялись главным образом в эксклюзионной хроматографии с колонками большого диаметра, то в настоящее время их все шире используют в ВЭЖХ.

 Ко всем соединениям, имеющим одинаковые функциональные группы, ИКД дает примерно одинаковые показания.

В связи с независимостью показаний ИКД от молекулярной массы анализируемых соединений он имеет значительные преимущества по сравнению, например, с РМД. Молярные показания ИКД практически постоянны.

Детектор достаточно стабильно работает при повышенных температурах (~ 150 °С) ячейки. В оптимальных условиях детектор может чувствовать около 1 мкг вещества с молекулярной массой 300, содержащего функциональную группу С—Н на длине волны 3,4 мкм. Более сильно абсорбирующие ИК-излучение функциональные группы обеспечивают более высокую чувствительность, которая, однако, в среднем не превышает чувствительность РМД.

Для детектирования в микроколоночной обращенно-фазной ВЭЖХ с использованием колонок из фторопласта с внутренним диаметром 0,5 мм и длиной 10 см ИКД можно устанавливать непосредственно на конце колонки. Колонка на длине 5 мм расплющивается, и образуется проточная ИК-ячейка с длиной светового пути около 30 мкм.

В специальной литературе описано несколько систем, объединяющих жидкостный хроматограф с ИК-спектрометром, основанным на использовании преобразования Фурье. Такая система позволяет, например, производить одновременную запись нескольких хроматограмм на выбранных оператором полосах ИК-спектра. Система позволяет анализировать органические вещества на уровне массы в 1 мкг и служит для идентификации компонентов пробы, причем неполностью разделенные хроматографические пики могут быть разрешены с помощью вычислительной техники.

Как видно из приведенных выше данных, фотометрические детекторы в настоящее время прочно занимают лидирующее положение среди ВЭЖХ детекторов, и они продолжают интенсивно развиваться. Ведется поиск новых источников излучения, конструкций проточных ячеек, методов регистрации и обработки сигналов. Эти исследования, несомненно, приведут к применению фотометических детекторов в новых областях науки  и техники.


Рефрактометрический детектор

В отличие от детекторов фотометрического типа, реагирующих только на вещества, поглощающие свет в УФ-, видимой и ИК-областях спектра, рефрактометрический детектор (РМД) является универсальным детектором в ЖХ.

Принцип действия РМД основан иа дифференциальном измерении показателя преломления чистого растворителя и раствора анализируемого вещества в этом растворителе. Вклад растворенного вещества в изменение показателя преломления растворителя пропорционален объемной концентрации этого вещества, причем растворитель также является детектируемым веществом, так как имеет определенный показатель преломления.

Схема дифференциального рефрактометрического детектора представлена на рис. 2.

 

 Рисунок 2. Дифференциальный рефрактометрический детектор.

Детектор содержит измерительную 4 и сравнительную 3 проточные камеры, через которые проходит луч света, излучаемый монохроматическим источником 1 через диафрагму 2. Объем измерительной камеры детектора не превышает 10 мкл. При протекании через измерительную и сравнительную камеры детектора чистого носителя фотоэлементы 7 равномерно освещены и регистратор 8 фиксирует нулевую линию. Появление в измерительной камере анализируемого вещества вызывает изменение угла преломления луча света, и на выходе призмы 5 два луча света по-разному освещают фотоэлементы. В детекторе с непосредственным отсчетом измерение угла преломления луча осуществляется по степени засветки одного из двух фотоэлементов. В компенсационным детекторе возникший разбаланс усиливается усилителем 9 и при помощи реверсивного двигателя 6 поворачивает компенсационную призму до тех пор, пока освещенность фотоэлементов не станет одинаковой. В состоянии равновесия угол поворота призмы пропорционален разности показателей преломления анализируемого газа и газа-носителя.

Принципиальная схема детектора, в котором реализуется компенсационный метод измерения, аналогична схеме, представленной на рис. 2.

Рисунок 3. Рефрактометрический детектор, основанный на измерении отраженного луча.

Рефрактометрический детектор, основанный на измерении отраженного луча, представлен на рис. 3. Детектор представляет собой призму 5, которая служит одной из стенок проточной камеры, расположенной в плате 8. Луч света от лампы 1, пройдя через диафрагму 2, светофильтр 3 и линзу 4, падает на поверхность призмы 5, контактирующей с анализируемой жидкостью. При изменении показателя преломления вещества, протекающего через камеру, изменится интенсивность отраженного и прошедшего через линзу 6 луча, измеряемая фоторезистором 7. Объем измерительной камеры детектора 5 мкл.

В связи с указанным выше РМД обладает средней чувствительностью, а его показания в сильной степени зависят от влияющих на состав подвижной фазы колебаний параметров, таких как: давление, температура и концентрация анализируемого вещества. Поэтому РМД практически неприменим в градиентной хромато графии.

В некоторых случаях могут быть выбраны пары растворителей, имеющие близкие показатели преломления n, например, н-гептан (п = 1,3855) и н-пропанол (n = 1,3854); н-гексан (n = 1,3754) и изопропанол (n = 1,3776); н-пропиловый эфир (n = 1.3807) и метилэтилкетон (n = 1,3807). При этом становится возможным градиентное элюирование в определенных пределах концентрации смеси растворителей.

Чувствительность РМД к изменениям температуры составляет для разных растворителей 5*10-4...5* 10-6 единиц показателя преломления (е. п. п.) или единиц рефракции (е. р.) на 1 °С, а к изменениям давления (1...5) 10-6 е. р./МПа.

Чувствительность РМД к температуре требует специальных мер по стабилизации температуры самого детектора и подвижной фазы при входе в детектор. В этом случае применение длинных соединительных трубок (теплообменников) на входе в детектор приводит к высокому экстраколоночному расширению пиков и снижает достигнутую в колонке эффективность разделения.

В хроматографах с РМД для обеспечения стабилизации потока элюента и сорбируемости примесей в колонке желательно применять ее термостатирование. Для реализации минимальной чувствительности РМД на уровне 10-8 е. р. погрешность термостатирования колонки не должна превышать ±0,01 °С. 
При хорошем термостатировании РМД относительно не чувствителен к изменениям расхода подвижной фазы. Детектор достаточно прост, удобен в работе, недеструктивен и отличается высокой воспроизгодимостью показаний.

Единственным крупным недостатком РМД является его нечувствительность к веществам, имеющим одинаковый показатель преломления с растворителем.

РМД может детектировать любые вещества независимо от температуры их кипения, структуры, молекулярной массы и других физико-химических свойств. Предел обнаружения для лучших РМД достигает 10-8 е. р. Шум РМД в 100 раз выше шума УФ-детектора. Детектор хорошо применим в тех случаях, когда нет необходимости в высокой чувствительности, например в препаративной хроматографии.

РМД достаточно широко применяется в эксклюзионной хроматографии, причем применение метода регистрации дифференциала удельного показателя преломления при анализе синтетических полимеров позволило повысить параметры РМД по сравнению с параметрами его аналогов.  Погрешность метода  1...2%. Одной из основных задач в области РМД является снижение уровня шумов. Путем применения нечувствительных к вибрациям двухлучевых систем удается снизить шумы до 5*10-8 е. р., а высокоточное термостатирование совместно с улучшением оптической системы позволяет уменьшить шумы до 1*10-8 е. р.

Основными проблемами в развитии РМД являются увеличение линейности, уменьшение постоянной времени и экстраколоночное расширение пиков. Проводятся работы по использованию «холод ных» источников света в области длин волн 900...1000 нм, применение которых позволит уменьшить влияние температуры на стабильность системы детектирования.
Интересным направлением повышения чувствительности РМД является применение лазерных источников света. Описано применение Не—Ne-лазеров с энергией 0,5...4,0 Вт. Путем пропуска ния через проточную ячейку луча ионного лазера получен косвенный метод регистрации поглощения по изменению показателя преломления вещества при нагреве пробы в ячейке. Такие детекторы имеют чувствительность на два порядка выше, чем стандартные.
 
Интерферометрический детектор
 
В основу интерферометрических детекторов положены интерференционные методы измерения показателя преломления веществ.  Для жидкостной хроматографии предложено использовать интерферометр Майкельсона с объемом измерительной камеры 161 мкл и длиной оптического пути 2 мм. Работа детектора (рис. 4) заключается в следующем.
 
 
 
Рисунок 4. Интерферометрических детектор Майкельсона.
Луч света, излучаемый источником 1, пройдя через щель 2, разделяется в полупосеребреной стеклянной пластине 3 на два когерентных луча, один из которых направляется к неподвижному зеркалу 5, а другой — к подвижному зеркалу 7. Лучи, отраженные от зеркал, вновь соединяются при помощи пластины 3 и выходят по направлению к фоторезистору 8 через диафрагму 10 и линзу 9. На пути луча, отраженного от зеркала 7, установлена проточная кювета 6, через которую прокачивается анализируемое вещество. Для компенсации луча, отраженного от неподвижного зеркала 5, установлена компенсирующая пластина 4. Изменяя положение пластины 4, можно обеспечить одинаковую разность хода лучей, тогда на входе диафрагмы 10 будут наблюдаться интерференционные полосы. При протекании через измерительную камеру детектора 6 чистой жидкости-носителя с помощью компенсирующей стеклянной пластины и подвижного зеркала 7 добиваются такой интерференционной картины, чтобы центральная ее часть, проецируемая на фоторезистор 8, была затемнена. Изменение показателя преломления жидкости-носителя приводит к смещению интерференционной картины и ее центральной части, проецируемой на фоторезистор. В результате смещения интерференционной картины на диафрагме самописца появляется последовательность пиков, причем каждый пик соответствует прохождению перед диафрагмой 10 освещенной интерференционной полосы. Установлено, что смещение дифракционной картины пропорционально числу молей анализируемого вещества в жидкости-носителе.

Флуориметрический детектор

Принцип действия флуориметрического детектора (ФМД) основан на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света. Исследования обычно проводят в УФ-области спектра при длине волны максимального поглощения для данной группы веществ, а излучение фиксируют через фильтр, не пропускающий лучи возбуждения. Длина волны флуоресцентного излучения всегда больше длины волны поглощенного света. В связи с тем, что детектирование ведется от нулевой интенсивности, ФМД более чувствительны по сравнению с детекторами поглощения.


Рис. 5. Фильтровый ФМД: 1 — источник света; 2 — блок питания; 3 — выход на регистратор; 4 — усилитель; 5 — ФЭУ; 6 — эмиссионные фильтры; 7 — кварцевые линзы; 8 — проточноая   ячейка;   9 — фильтры   возбуждения.

Обычно используется прямоугольный принцип измерения флуоресценции в ФМД. Свет от источника излучения 1 (рис. 5) пропускается через фильтры 6 и фокусируется в проточной ячейке 8 с прямоугольным расположением каналов ввода и вывода света. Эмиссионное излучение проходит через фильтры 6 и измеряется с помощью фотоприемника 5. При использовании ФМД подвижная фаза (растворитель) не должна поглощать свет ни на длине волны поглощения, ни на длине волны излучения.

Для сильнофлуоресцирующих веществ чувствительность детектора достигает 10-9 г/мл. При соответствующем выборе системы растворителей ФМД пригоден для использования в градиентной хроматографии.

С помощью ФМД с высокой чувствительностью можно детектировать аминокислоты, амины, витамины и стероиды. Высокая чувствительность является одним из главных преимуществ ФМД.

Высокая селективность и чувствительность ФМД позволяет также проводить количественный анализ микропримесей веществ и качественное определение ароматических углеводородов, биологически важных соединений, метаболитов и других флуоресцирующих соединений.

Для сильнофлуоресцирующих веществ чувствительность детектора достигает 10-9 г/мл. При соответствующем выборе системы растворителей ФМД пригоден для использования в градиентной хроматографии.
С помощью ФМД с высокой чувствительностью можно детектировать аминокислоты, амины, витамины и стероиды. Высокая чувствительность является одним из главных преимуществ ФМД.
Высокая селективность и чувствительность ФМД позволяет также проводить количественный анализ микропримесей веществ и качественное определение ароматических углеводородов, биологически важных соединений, метаболитов и других флуоресцирующих соединений.

 Техника косвенного ФМД представляет дополнительные возможности для расширения областей применения детектора. Разработаны химические методы пред- и послеколочночного получения флуоресцирующих производных большого круга органических соединений при реакциях с веществами, содержащими флуоресцирующие функциональные группы. Продемонстрирована перспективность использования послеколоночных реакций для получения флуоресцирующих производных, которые позволяют получить почти в 100 раз большие чувствительность и селективность по сравнению с соответствующими параметрами УФД, например, при определении гербицидов в образцах почвы. Результаты изучения реакций хлоранилинов с одним из флуоресцирующих аминов могут быть применены при анализе этих соединений, содержащихся в сточных водах промышленных предприятий в качестве побочных продуктов производства пестицидов и красок. Интересно использование ФМД для анализа катехоламинов и пептидов в биологических жидкостях и некоторых лекарствах, при определении флувоксамина, клавоксамина, сековерина в плазме и сыворотке крови.

Предложено применять безоконную кварцевую кристаллическую проточную ячейку для одновременного флуоресцентного, фотоакустического и фотоионизационного двухфотонного детектирования при анализе ароматических соединений. В качестве источника возбуждения использован Хе—Cl-лазер на 308 нм, сфокусированный в центре потока элюента в кварцевой ячейке. Объем ячейки 6 мкл. Рассматриваемая система сравнивалась с УФД. Ее преимуществом является возможность одновременного применения трех методов детектирования при одной конструкции. Предел детектирования на порядок ниже, чем у стандартного УФД.

Применение ФМД в ВЭЖХ дает возможность повысить селективность детектирования целого ряда соединений. Получение флуоресцирующих производных с помощью химических реакций значительно расширяет эту возможность. Флуоресцентное детектирование с одновременным изменением рН подвижной фазы после колонки позволяет увеличить флуоресценцию некоторых соединений и делает ФМД более селективным.

Селективность детектирования может быть также увеличена путем более тщательного выбора длины волны детектирования. Одновременное сканирование длин волн возбуждения и эмиссии позволяет определить чистоту пика и провести идентификацию анализируемых соединений. Применение дискретных источников возбуждения для ФМД обеспечивает более высокую интенсивность флуоресценции, большую воспроизводимость и меньший предел детектирования. Кроме Hg-лампы на 254 нм применяются Zn-лампа на 214 и 308 нм и Cd-лампа на 229 и 326 нм.

Предел детектирования для сильно флуоресцирующих веществ доведен до 5*10-10 г.

В заключение следует еще раз отметить, что ФМД в настоящее время является одним из самых чувствительных детекторов в ЖХ. Кроме того, он отличается достаточно высокой линейностью и регулируемой селективностью. Поэтому не вызывает сомнений целесообразность дальнейшего расширения работ в этой области, перспективность которых очевидна.


Электрохимические детекторы


 В ВЭЖХ наряду с широким применением оптических детекторов за последние  годы наметился значительный прогресс в развитии электрохимического метода детектирования. Доказательством этого является увеличение числа публикаций по разработке и применению электрохимического детектора (ЭХД) и главным  образом  увеличение  выпуска  аппаратуры,   пригодной  для практического использования.

Благодаря  высокой  чувствительности  и  селективности ЭХД  особенно эффективен при анализе некоторых важных для биохимии  и медицины соединений,  таких  как эстрогены и  катехоламины,  присутствующие в малых концентрациях в тканях, крови и других  сложных объектах  исследования.  ЭХД с успехом  используется также для анализа веществ при исследовании загрязнений окружающей среды ввиду его высокой чувствительности и селективности к фенолам, бензидинам, нитросоелинениям, ароматическим аминам и пестицидам.

Наибольшее применение ЭХД нашел в обращенно-фазовой и ионообменной ВЭЖХ, в которой применяют полярные элюенты, содержащие растворенные ионы и обладающие достаточно высокой электрической проводимостью. В нормально-фазовой ВЭЖХ также можно  использовать ЭХД, если  после разделительной  колонки в неполярную подвижную фазу добавлять электролит или под ходящий растворитель с высокой диэлектрической постоянной.

ЭХД основаны на определении электрохимических свойств соединений в потоке элюента, главным образом реакционной способности к окислению или восстановлению на электроде.

Рассмотрим конструктивные особенности и основные характеристики некоторых типов ЭХД.

Вольтамперометрический детектор

Наиболее распространенными в ЖХ из всех ЭХД являются вольтамперометрические детекторы (ВАД). Они применяются для анализа широкого круга неорганических и органических веществ. Работа ВАД основана на получении зависимости между силой тока, протекающего через ячейку, напряжением, приложенным к электродам, и концентрацией восстанавливающегося (или окисляющегося) на измеритель ном (рабочем) электроде вещества.

Большинство неорганических ионов могут быть электрохимически окислены или восстановлены. Среди органических соединений электроактивными являются соединения с кратными связями, окисляемыми или восстанавливаемыми функциональными группами, ароматические и другие соединения.

Поскольку для каждого класса электроактивных соединений характерен определенный потенциал окисления или восстановления, этот потенциал и определяет селективность детектора. На практике метод окисления осуществить проще, так как из элюента и из пробы не надо удалять растворенный кислород. В детекторе имеются по крайней мере два электрода: рабочий и сравнительный, по отношению к которому устанавливается потенциал рабочего электрода. В качестве сравнительного чаще всего используется каломельный или Ag/AgCl-электроды. В некоторых детекторах дополнительно устанавливается вспомогательный электрод, необходимый для подавления влияния омического падения напряжения в растворах низкой проводимости.

Вольтамперометрическими в ЖХ являются такие детекторы, в которых измеряется ток как функция времени при постоянном' потенциале на неподвижном электроде, окруженном движущейся жидкостью (элюентом). Иногда такие детекторы ошибочно называют полярографическими, хотя общепринято полярографическими детекторами считать только детекторы с капельным ртутным электродом. При превращении органического вещества А в его окисленное соединение 0 выделяется один или более электронов е- на одну реагирующую молекулу. Начальные продукты электродных реакций очень нестабильны и необратимо реагируют с образова нием стабильных соединений Р, которые больше не реагируют на поверхности электрода и удаляются потоком элюента из ячейки детектора. На электрод должен быть подан потенциал, достаточный для первичного превращения А в О. Установившийся ток прямо пропорционален  числу  n электронов, константе Фарадея F и числу молей вещества, реагирующих в единицу времени (dN/dt):

 I = n*F*dN/dt.

  При интегрировании хроматографической зоны максимальный ток зависит от числа молей N соединения, фактически вступившего в реакцию на поверхности электрода:

 Q= nFN. 

Таким   образом, эффективность ячейки  детектора определяется соотношением числа молей N, вступивших в реакцию, к общему числу молей Nобщ, выходящих из хроматографическон колонки:

Э = (N/Nобщ)/100%.

Эффективность сложным образом зависит от конструкции ячейки и расхода потока подвижной фазы.

 

Рис.6 Конструкция тонкослойной ячейки ВАД.

1,3-корпус ячейки из двух пластин; 2-прокладка; 4-рабочий электрод; 5-стягивающие пластины; 6,7-выход и вход элюента.

Теоретически показано, что может быть сконструирована ячейка, обладающая 100%-ной эффективностью, однако такая ячейка непригодна для проточного ЭХД. В большинстве случаев на практике эффективность ЭХД составляет 10% и меньше. Конструкция тонкослойной ячейки ВАД представлена на рис. 3. Блок ячейки «сэндвичевого» типа из пластмассы, обычно фторопласта-3, спрессован с прокладкой из фторопласта-4 толщиной около 50 мкм, которая образует прямоугольный канал. Рабочий электрод встав лен в стенку блока. Некоторое увеличение эффективности может быть достигнуто путем увеличения площади рабочего электрода или использования двух электродов, расположенных по обе стороны от входа потока элюента.

Материал электрода влияет на характеристики ЭХД. Органические соединения окисляются или восстанавливаются с разными скоростями на поверхности различных электродов. Желательно, чтобы электродные реакции протекали с максимально возможной скоростью, чтобы ток ячейки определялся только массопередачей молекул к поверхности, а не реакцией на поверхности. Таким образом, материал электрода необходимо выбирать с учетом его собственного окисления или восстановления и возможной электрохимической реакции компонентов, составляющих подвижную фазу (вода, органические растворители, соли, примеси). Эти электронные реакции обусловливают основную часть фонового тока. Для любых электродов и во всех подвижных фазах фоновый ток увеличивается экспоненциально в зависимости от приложенного потенциала. Поэтому при высоких отрицательных и положительных потенциалах эксплуатация детектора затруднена. Детектор работает с большой чувствительностью, селективностью и воспроизводимостью при детектировании легко окисляющихся или восстанавливаемых соединений.

В качестве материалов для электродов ячеек ЭХД применяются стеклоуглерод, углеродная паста, ртуть и амальгамированное серебро или платина. Углеродная паста (смесь спектроскопичес кого графитового порошка и диэлектрического материала, такого как минеральное масло, силиконовое масло, парафиновый смазочный материал) — наиболее широко используемый материал, имеющий свойства, необходимые для проведения органических электрохимических реакций.

Хроматография предъявляет следующие требования к материалу электродов и их поверхности: невысокие значения применяемых потенциалов; химическая и физическая совместимость с подвижной фазой; длительная стабильность.

Обычно эти три требования тесно связаны между собой. Углеродная паста имеет следующие характеристики: время жизни — обычно несколько месяцев; потенциалы — не менее +0,95 В при использовании Ag/AgCl в качестве материала для сравнительного электрода; подвижная фаза может содержать органический растворитель высокой концентрации.

В ряде случаев требуется достаточно частое обновление поверхности электродов. В классической вольтамперометрии (включая полярографию) считается, что такие молекулы пробы, как липиды или белки, «отравляют» поверхность электродов после нескольких вводов пробы. Присутствие высокомолекулярных соединений в потоке приводит к серьезным проблемам, так как такие вольтамперометрические измерения проводятся для проб с концентрациями более 10-5...10-3 моль/л. В этом случае электродная реакция может привести к образованию полимера, который «пассивирует» поверхность и приводит к невоспроизводимым результатам анализа. В случае хроматографического амперометрического детектирования колонка очищает ПФ, поток ПФ непрерывно очищает поверхность электрода, концентрации пробы находятся в диапазоне 10-8... 10-6 моль/л. Кроме того, электрод подвержен единичному воздействию некоторого вещества в течение короткого временя, соответствующего ширине зоны этого вещества в ЖХ. Все указанные факторы облегчают работу электрода при хроматографическом амперометрическом детектировании по сравнению с прямыми (нехроматографическими) электрохимическими измерениями.

Потенциометрический детектор

Метод потенциометрического детектирования (ПЦД) концентрации ионов в потоке основан на измерении разности электрических потенциалов двух электрдов, один из которых в процессе измерения имеет постоянный потенциал. Так как абсолютную величину электродного потенциала измерить невозможно, измеряют потенциал измерительного (индикаторного) электрода относительно потенциала сравнитель ного электрода, который должен быть постоянным.

В потенциометрическом детекторе (ПЦД) в качестве сравни тельного обычно используется хлорсеребряный электрод. Наиболее часто потенциометрический метод измерения применяют в рН-метрии. Для точных измерений с ионселективными электродами подвижная фаза должна иметь относительно высокую и постоянную ионную силу. Следовательно, ПЦД имеет ограниченное применение для неорганических систем без градиентного элюирования. Основное преимущество ПЦД заключается в следующем: при потенциометрических измерениях не надо удалять из элюента и анализируемой пробы растворенный кислород, как, например, при полярографических измерениях.

Разработан дифференциальный ПЦД, состоящий из двух камер, разделенных ионообменной мембраной. Элюент с анализируемым веществом проходит через одну камеру, а чистый элюент — через другую. Записываются потенциалы мембраны с использованием двух сравнительных электродов. Предел детектирования 1 нмоль.

 Полярографический детектор

В 1958 г. для ВЭЖХ был предложен полярографический детектор (ПГД) с ртутным капельным электродом. Однако его использование до настоящего времени ограничено. При работе с ПГД измеряется сила электрического тока между поляризуемым и неполяризуемым электродом при заданной постоянной разности потенциалов. В режиме восстанов ления из элюента и из пробы необходимо удалить растворенный кислород и примеси металлов. В последующие годы появились улучшенные конструкции ПГД. ПГД находят применение для определения нитроанилинов нитрофенолов, хлорнитробензолов, нитроалканов, нитронафталинов, n-метоксиазобензолов, N-нитрозоаминов, стероидов.

Кулонометрический детектор

Эти детекторы названы так в связи с тем, что анализируемые вещества в них электризуются полностью в отличие от амперметрических, в которых эффектив ность электролиза не превышает 10%. Кулонометрические детек торы (КМД) имеют рабочие электроды с большой поверхностью.

КМД используется для селективного определения витаминов, наркотиков и лекарственных препаратов. Для детектирования соединений с высокими окислительно-восстановительными потен циалами применен принцип двух последовательно расположенных Рабочих электродов, один из которых (вышестоящий по ходу потока является кулонометрической ячейкой для полного окисления примесных веществ с более низкими потенциалами, чем анализи руемые соединения. Детектирование последних осуществляется вольтамперометрической ячейкой. Система ВАД— КМД позволяет провести селективное детектирование неразделенных пиков.

 Преимуществами ЭХД любых типов являются простота конструкций и низкая стоимость, с одной стороны, и высокая чувствительность и селективность — с другой. Причем имеется возможность регулирования селективности путем смены режимов работы детекторов, замены или модифицирования электродов.

Для ЭХД можно реализовать малый рабочий объем (до 1 нг и меньше) по сравнению с другими ВЭЖХ детекторами. ЭХД малым рабочим объемом может быть применен в микроколоночной и капиллярной хроматографии, что особенно актуально в связи с их быстрым развитием. Преимуществом ЭХД является также малая зависимость их показаний от температуры.

К недостаткам ЭХД следует отнести уменьшение их чувствительности со временем в связи с изменением характеристик электродов, применение ртути в некоторых типах ЭХД, зависимость сигнала от расхода элюента и ограниченное применение в ВЭЖХ при градиентном элюировании.

Детектор радиоактивности

Разделение и количественное определение радиоактивных веществ находит достаточно широкое применение при анализе меченых соединений в целях дозиметрического контроля при изучении химических реакций в органической и неорганической химии, биологии, микробиологии и медицине при биомедицинских исследованиях.

Известны два принципиально различных типа детекторов радиоактивности (РАД) для ЖХ.

РАД первого типа основан на методе предварительного смешивания раствора сцинтиллятора с элюентом перед входом в детектор с последующим пропусканием смеси через сцинтилляционный счетчик. Такой метод обычно называют методом жидких сцинтилляторов.

Второй тип РАД основан на использовании проточных ячеек сцинтилляционных счетчиков, заполненных частицами твердых сцинтилляторов. Например, для обнаружения ß-излучения в потоке элюента применялись твердые сцинтилляторы в виде стеклянных шариков, содержащих 2,5...7,7% лития, с общей массой около 0,5 г. Обычно проточные ячейки для РАД изготавливают из стекла или фторопласта.

Наибольшую трудность при применении РАД представляет собой обеспечение необходимой скорости счета, которая прямо пропорциональна рабочему объему детектора и обратно пропорциональна расходу потока элюента. РАД измеряет активность потока элюента в проточной ячейке и преобразует ее в напряжение выходного сигнала. При этом необходимо также учитывать фоновый сигнал, причем скорость фонового счета обычно составляет около 30 счетных единиц в минуту. При увеличении рабочего объема V детектора и уменьшении расхода потока W элюента чувствительность РАД при прочих равных условиях увеличивается. Однако эти изменения приводят к ухудшению достигнутого на колонке разрешения. С уменьшением V при постоянном W и при сохранении эффективности разделения падает чувствительность детектора. Пропорциональное изменение V и W в сторону их уменьшения или увеличения не изменяет чувствительности детектора, что означает одинаковую чувствительность и универсальность применения его как в аналитической, так и в препаративной хроматографии.  Рекомендуется, чтобы объемячейки РАД был не более 0,1 объема элюента, в котором выходит первый пик хроматограммы анализируемой смеси. При применении твердых сцинтилляторов получены следующие значения эффективности счета: 6% для 3Н; 10% для 32I; 70% для 15С и 7% для 123I. В этом случае эффективность счета зависит также и от размера частиц сцинтиллятора. Уровень шума соответствует наличию ЭН в пробе в количестве (2...6) 10-14 моль.

Преимуществами РАД являются хорошая воспроизводимость показаний, большой диапазон линейности детектирования, нечув ствительность к изменениям потока элюента и в связи с этим применимость при градиентном элюировании, низкий предел детек тирования (около 100 счетных единиц в минуту для 14 c), применимость в препаративной хроматографии и для большого круга b а- и у-радтоактивных элементов.

Детектор по светорассеиванию

Детектор по измерению светового рассеяния (СРД), основан на различии в давлении паров обычно используемых в ЖХ растворителей и анализируемых веществ. Принципиальная схема детектора приведена на рис. 7.

Рис. 7.  Детектор   светового  рассеяния: 1 — вход элюента; 2 — подводящая трубка; 3 - уплотнение; 4 — сопло; 5 — камера распыления; 6 — нагреватель; 7 — корпус детектора; 8 — камера испарения; 9 — трубка для выхода луча; 10 — камера светорассеяния; 11 — трубка для выхода по. тока; 12 — стеклянное окно; 13 — двойная дкафраг. иа;  14 — стеклянный стержень.

Элюент на выходе из колонки 1 распыляется в камере 5 при повышенной температуре. В камере испарения 8 растворитель испаряется, а поток частиц нелетучих анализируемых веществ рассеивает свет лазерного луча в камере светорассеяния, в которой имеется стеклянный стержень 14, расположенный перпендикулярно лучу лазера на расстоянии 2...5 мм от него. Стержень служит в качестве коллектора рассеянного света. Через стержень часть рассеянного света попадает на фотоумножитель. Показания СРД пропорциональны массовой скорости потока вещества, что особенно важно при его использовании с колонками малого диаметра. Фоновый ток СРД при включенном лазере и установленном потоке предварительно нагретого несущего газа (CO2 или N2) около 2*10-10 А; шум 1*10-11А. Вклад СРД в расширение полосы пробы 0,1...0,2 мкл. Нулевая линия стабильна даже привысоком градиенте концентраций, однако показания пропорциональны массовому потоку анализируемого вещества в степени 1,8. Предел детектирования при анализе метиловых эфиров жирных кислот и триглициридов в различных пробах около 150 нг/с. Основным требованием является условие, чтобы анализируемые вещества были жидкими или твердыми при температуре детектора.

Классификаця детекторов

Основные типы классификации детекторов

Классификация по способу обработки (отображения) поступающего сигнала

Классификация по физической природе детектора: физические, физико-химические и биологические

Классификация по воздействию детекторов на аналит : деструктивные и недеструктивные

Классификация по чуствительности
 
Классификация по селективности
 
Классификация детекторов для газовой хроматографии
 
Классификация детекторов в жидкостной хроматографии

Классификация детекторов в тонкослойной хроматографии
 


Классификация по способу обработки (отображения) поступающего сигнала

Детекторы в хроматографии разделяются на дифференциальные (ДД) и интегральные (ИД).
При дифференциальном методе детектирования количество компонента, выходящего из колонки к определенному моменту времени, определяется значением интеграла по времени от про­изведения расхода W газа на его концентрацию в данный момент времени (\WCt). Если считать W постоянной, что действительно соблюдается для малых концентраций компонентов в подвижной фазе (ПФ),  то  интеграл  концентрации  компонента  по времени пропорционален площади под хроматографической кри­вой.
 

Рис. 1. Дифференциальная (а) и  интегральная (б) хроматограммы:
1—3 — хроматографнческие   пики,   соответствующие   комповентам    разделяемой  смеси.
 
Таким образом, хроматографический пик (рис. 1, а) является дифференциальной кривой количества выходящего из колонки компонента. Обычно в ДД изменение какого-либо физико-хими­ческого свойства сравнивается с изменением того же свойства ПФ при одинаковых условиях. В этих случаях используются две измерительные ячейки, одна из которых является рабочей, а другая сравнительной. Через сравнительную ячейку пропуска­ется дополнительный поток ПФ. Часто о таком способе получения сигнала детектора также говорят как о дифференциальном. Однако этот метод не следует смешивать с дифференциальным мето­дом детектирования, при котором даже одна рабочая ячейка является ДД. Метод применения двух ячеек .детектора с целью компенсации флуктуации параметров эксперимента, таких как температура, давление, скорость потока и другие, следует назы­вать разностным методом в отличие от дифференциального метода детектирования. 
При интегральных методах детектирования регистрируется не мгновенная концентрация вещества, а его общее количество на выходе из хроматографической колонки. Поэтому ИД не тре­буют  проведения  специальной   калибровки.
Хроматограмма смеси нескольких компонентов, полученная интегральным методом детектирования, при условии их полного разделения состоит из ряда ступеней, отделенных друг от друга участками, параллельными нулевой линии (рис. 1, б). Такая хроматограмма подобна хроматограмме, характерной для фрон­тального метода анализа многокомпонентной смеси с применением ДД.
При расчете состава смеси высоты ступеней, соответствующие отдельным компонентам, складываются. В интегральном методе детектирования необходимо исключить влияние ПФ на показания детектора. Это осуществляется путем химического ее удаления или посредством извлечения анализируемых веществ из потока ПФ с помощью поглотителей с последующим сбором и определе­нием  количеств  компонентов  смеси.

Наиболее распространенными интегральными методами де­тектирования являются методы титрования. В ГХ известны также методы измерения объемов выходящих из колонки веществ при постоянном давлении или измерения давления при постоянном объеме с удалением газа-носителя. В качестве газа-носителя обыч­но используется СО2, который затем поглощается концентрирова­нным  раствором  щелочи.
Таким образом, для ДД площадь S хроматографического пика пропорциональна количеству компонента, выходящего из ко­лонки за интервал времени t1-t2. Высота ступени h хроматограммы интегрального детектора пропорциональна массе компо­нента, выходящего из  колонки за время  t1-t2.
Так как ИД, обладающие малой чувствительностью, точно­стью, воспроизводимостью и недостаточным быстродействием, практически не нашли распространения в хроматографической практике, поэтому в разделе основное внимание уделено дифферен­циальным методам детектирования.
Классификация по отклику на скорость потока: концентрационные, потоковые и массовые.
Сигнал ДД может быть пропорционален концентрации или массе (потоку) компонента. В зависимости от этого детекторы под­разделяют на концентрационные и потоковые. В концентрационном детекторе существует прямая пропорцио­нальность между его выходным сигналом ас и концентрацией С анализируемого вещества в объеме детектора. 

ас=AcC
, где Ас-коэффициент пропорциональности, характеризующий чувствительность детектора.

Таким образом, для концентрационного детектора площадь пика обратно пропорциональна расходу ПФ через него и прямо пропорциональна количеству (массе) компонента, поэтому с уве­личением расхода газа (жидкости) площадь пика уменьшается, а высота не изменяется (рис. 2, а). Концентрацию рассчитывают по площади пика.



 

Рис. 2. Зависимость показаний детектора от расхода подвижной фазы: а) — концентрационного; h1=h2=h3=h; S1 > S2 > S3; б — потокового; h3>h2>h1; S1 = S2 = S3;     W1 > W2 > W3 — расходы подвижной фазы.
Сигнал потокового детектора определяется количеством ве­щества, попадающего в детектор в единицу времени, т. е. потоком вещества, j=dG/dt.
Для потокового детектора сигнал aj = Ajj, где Aj — коэф­фициент пропорциональности, постоянный в линейной области детектора.
Для потокового детектора с увеличением расхода ПФ площадь пика не изменяется, а его высота увеличивается, так как при этом увеличивается поток компонента (рис. 2, б).

 Можно также выделить массовые детекторы, сигнал которых прямо пропорционален массе поступающего в них вещества. К массовым детекторам относятся все ИД, в которых происходит накопление вещества и, следовательно, сигнала. Сле­дует отметить, что если для концентрационного детектора расход ПФ не остается постоянным, то его нельзя отнести ни к одному из указанных выше типов детекторов. На практике, чтобы уста­новить, является детектор концентрационным или потоковым, строят зависимость показаний детектора от расхода ПФ. Существуют статический и динамический методы определения типа детекторов. При статическом методе обычно при различных расходах ПФ вводят пробы и измеряются площади полученных пиков. Строят зависимости площади пика от расхода (рис. 3, а) или логарифма площади от логарифма расхода ПФ (ряс. 3, б).

Рис 3. Зависимость площади пика от расхода ПФ детекторов: 1— потокового;   2 — концентрационного;   3 — промежуточного.
 
В логарифмических координатах идеальный концентрацион­ный детектор имеет характеристику в виде прямой с наклоном 45° к оси расходов, а идеальный потоковый детектор — в виде прямой, параллельной оси расходов. Некоторые типы детекторов не всегда можно отнести к потоковому или концентрационному. Для них зависимости площади от расхода имеют промежуточное вначение (рис. 3, б).И потоковые, и концентрационные детекторы широко исполь­зуются в хроматографии. Так как высота хроматографических пиков для концентрационного детектора не зависит от расхода, можно применять метод измерения высот пиков при постоянной температуре колонки. Для потоковых детекторов проводить ана­лиз хроматограмм по высотам пиков можно только в случае по­стоянного расхода ПФ. Однако их показания мало зависят от температуры анализа и не зависят от давления, что является их определенным преимуществом по сравнению с концентрационными детекторами. В то же время с помощью концентрационных детек­торов можно более точно измерить время удерживания, так как их показания зависят от расхода газа (при ГХ).
 

Классификация по физической природе детектора: физические, физико-химические и биологические

 К физическим детекторам обычно относят детекторы, принцип действия которых основан на измерении физических свойств ана­лизируемых веществ и ПФ. К таким физическим свойствам от­носятся, например, молекулярная масса, плотность, теплопровод­ность, теплоемкость, потенциал ионизации, сечение ионизации, сродство к электрону, электрическая проводимость, показатель преломления, диэлектрическая постоянная, поглощение света, флуоресценция, хемилюминесценция и другие. К физическим де­текторам относятся также ультразвуковой детектор, детекторы для измерения радиоактивных веществ, контактной разности по­тенциалов, детекторы по подвижности электронов и некоторые другие. Таким образом, большинство применяемых в хроматогра­фии детекторов являются физическими детекторами.
В физико-химических детекторах анализируемые вещества в процессе детектирования вступают в химические реакции. Продукты реакции фиксируются (как, например, при детектиро­вании с конверсией) на основе измерения показателей их физиче­ских свойств. Измеряются также теплота химических реакций, температура пламени, ионизационные токи и световая эмиссия при сгорании органических соединений, потенциалы растворов при титрировании и другие характеристики, полученные в резуль­тате химических реакций с анализируемыми веществами. Особое место занимают реакционные детекторы, основанные на использовании принципа дериватизации анализируемых веществ.

 
Биологические детекторы применяются исключительно редко и в основном для детектирования биологически активных веществ. Во многих случаях в качестве детекторов используются биологиче­ские объекты, которые помещаются непосредственно на выходе хроматографической колонки. Такие детекторы иногда бывают на несколько порядков более чувствительны, чем физические и физико-химические детекторы. Однако недостаточное их быстро­действие и невозможность количественной оценки, а также раз­витие за последнее время детекторов для анализа биологически важных веществ (например, ДЭЗ) ограничивают использование биологических детекторов. Для анализа пахучих веществ в пар­фюмерии и пищевой промышленности иногда применяют специ­альные устройства (типа воронки) для использования человече­ского носа в качестве детектора. 

Классификация по воздействию детекторов на аналит : деструктивные и недеструктивные


Недеструктивными называются детекторы, в которых в про­цессе детектирования концентрация анализируемых веществ в ПФ не меняется, иначе говоря, в детекторе не происходит химиче­ских превращений и отсутствуют потери измеряемых компонентов смеси. В связи с этим возможна многократная регистрация анали­зируемых соединений с применением нескольких следующих друг за другом детекторов.
В деструктивных детекторах в результате химических реак­ций, а также изменения физических свойств вещества концентра­ция анализируемых веществ уменьшается- вплоть до полного ис­чезновения, причем это уменьшение зависит от полноты превра­щения веществ. Поэтому возможна только одноразовая регистра­ция, а при необходимости использования нескольких детекторов деструктивные детекторы устанавливаются последними. Следова­тельно,   все   химические  детекторы   являются   деструктивными.
Большинство физических детекторов не являются деструктив­ными. Однако в некоторых типах ионизационных детекторов в ре­зультате ионизации, захвата электронов и рекомбинации ионов значительная доля анализируемых веществ претерпевает опре­деленные изменения, поэтому такие детекторы иногда также от­носят к деструктивным. Следует иметь в виду, что в том случае, когда ионизируется только 0,1% введенного в детектор вместе с потоком ПФ анализируемого соединения (эффективность иониза­ции я=:10~3), детектор можно считать недеструктивным и применять в схемах, используемых для недеструктивных детекторов. ДЭЗ, для которых эффективность ионизации иногда равна 100%, очевидно, следует отнести к деструктивным детекторам.

Классификация по чуствительности

 
Одной из основных характеристик детекторов является их чувствительность. Иногда детекторы подразделяют на детекторы низкой, средней и высокой чувствительности. Разделение, есте­ственно, условное. К детекторам низкой чувствительности обычно относят все типы ДТП в ГХ и РМД в ЖХ.
Высокочувствительными детекторами считаются ДПИ, ДЭЗ, ДТИ, ФМД, ЭХД и МС. Все остальные детекторы относятся в той или иной мере к одной из трех групп, причем иногда для одних веществ детектор является высокочувствительным, а на другие почти не реагирует. Поэтому используется также разделение' де­текторов   на селективные и неселективные.

Классификация по селективности

 
В течение всего периода развития хроматографии исследова­ние детекторов в целях их применения для количественного хро-матографического анализа было направлено в первую очередь на поиск систем, дающих примерно одинаковые показания ко всем детектируемым соединениям. Очевидным преимуществом таких систем является универсальность и сведение калибровки детектора до минимума. Однако аналитический метод должен предусматри­вать не только возможность разделения и измерения количества компонентов, но и способы идентификации каждого компонента после разделения.
Хроматография по большинству качеств является универсаль­ным аналитическим методом. Однако идентификация компонентов требует применения трудоемких методов сбора и анализа различ­ными методами каждого компонента после выхода его из хромато-графической колонки. А так как разделительная способность хроматографических колонок увеличивается с уменьшением раз­мера пробы, применение малых проб (около 10~9 г и меньше) ста­новится обычным явлением. Сбор и идентификация таких проб практически невозможны. Поэтому наряду с развитием универ­сальных детекторов в последнее время существенное распро­странение получили селективные детекторы разных типов, осно­ванные на использовании таких различий, как присутствие неко­торых специфических атомов или функциональных групп в моле­кулах, способность захватывать свободные электроны, и некото­рых других.
Селективные детекторы позволяют определить специфические соединения в сложных смесях без разделения, сбора и анализа отдельных фракций и обеспечивают дополнительную возможность анализа соединений, имеющих одинаковые удерживаемые объемы.
К таким селективным специфическим детекторам в первую очередь относятся ДЭЗ и ДТИ в ГХ, ФМД и ЭХД в ЖХ.
 

Классификация детекторов для газовой хроматографии

 
Как уже отмечалось, детекторы в ГХ подразделяют на: диф­ференциальные и интегральные; физические, физико-химические и биологические; универсальные и селективные, физико-химиче­ские и биологические детекторы, как правило, селективные. Из них к универсальным можно отнести только ДПИ, и то с учетом, что он регистрирует главным образом органические соединения.
Основную группу селективных физико-химических детекторов (по количеству и распространенности) составляют пламенные и плазменные детекторы. К первым относятся прежде всего ДТИ в режимах детектирования Р и N и ДПФ в режимах детектиро­вания Р и S. Имеется большое разнообразие плазменных детек­торов, различающихся между собой лишь способом создания плаз­мы   (радиочастотная   плазма,   низкочастотная   плазма   и   т.   п.).
Физические детекторы могут быть универсальными и селек­тивными, причем и тех и других достаточно много. К настоящему времени уже испробованы почти все физические принципы, кото­рые могут быть положены   в основу детектирования. Среди универсальных физических детекторов по простоте и широте применения выделяются тепловые детекторы: ДПТ и ДП. Из селективных наиболее часто применяются ДЭЗ, Не—ИД и МС. Однако здесь следует помнить, что применение селективного детектора для определения даже небольшого круга анализируемых веществ часто позволяет решать глобальные аналитические задачи (например, анализ пестицидов в пищевых продуктах), имеющие большую экономическую и экологическую эффективность.
Особое место среди физических детекторов в ГХ занимают оптические детекторы, которые могут быть отнесены как к универсальным, так и к селективным устройствам. Например, ДфИ при энергии фотонов 11 э • В или УФД при длине волны поглощения света 254 нм могут быть универсальными для достаточно большой группы анализируемых веществ и стать селективными при соответствующем выборе энергии фотонов или длины волны поглощения света. Обозначения детекторов представлены в алфавитном указателе терминов.

Классификация детекторов в жидкостной хроматографии

К настоящему времени предложено более 20 различных типов детекторов для ЖХ. Основную массу предложенных детекторов можно разделить на следующие классы: оптические, электрические, электрохимиче­ские и детекторы для измерения радиоактивных веществ. Основны­ми детекторами в ЖХ являются оптические. Уже имеются детекторы, основанные на поглощении света в УФ-, ИК: и видимой областях света, на флуоресценции, хемилюминесценции, реф­ракции, поляризации,  рассеянии света.

К оптическим детекторам кроме УФД,  ИКД,  РМД и ФМД относятся также все детекторы, в которых используются лазерное •    излучение, такие как СРД, ФАД, ФКД, ФИД и ПЛД.

Регистрация сигнала в оптических детекторах осуществляется: на фиксированной длине волны; с помощью фильтров на несколь­ких длинах волн; при переменной длине волны, устанавливаемой вручную или автоматически. Имеются спектральные детекторы со сканированием спектра в определенном диапазоне длин волн с помощью дифракционной решетки или фотодиодной  матрицы.

Оптические детекторы разделяют также по способу регистрации' сигнала. Различают детекторы прямого действия, в которых ис­пользуются прямая зависимость оптического свойства среды от концентрации анализируемого вещества, и непрямыву-в-каторых . анализируемое вещество само не регистрируется, а лишь вызывает— изменение оптического свойства среды. Оптические детекторы в ЖХ различаются также по источникам света. В них использу­ются ламповые и лазерные источники света, эффект Черепкова или источники излучения для создания потока света необходимой длины волны. В последнее время стали делить детекторы по спо­собу обработки выходной информации. Например, разработаны детекторы,     основанные  на     использовании     преобразования Фурье.

К электрическим детекторам обычно относят ДПД, ЕМД и некоторые другие.

В капиллярной и микроколоночной ЖХ все большее приме­нение находят такие распространенные газохроматографические детекторы, как ДЭЗ, ДТИ, ДПФ. Особенно перспективно объеди­нение капиллярных ЖХ-колонок с приборами физико-химического анализа: МС, АЭС, ААС, ЭПР, ЯМР и др.

Основным детектором в ионной хроматографии является ДПЭ. Большое распространение в ЖХ приобрели детекторы по радио­активности, что связано главным образом с расширенным приме­нением сложных меченых органических соединений при биологи­ческих и медицинских исследованиях. Особо следует отметить развитие после коло ночных реакционных детекторов, в состав которых обычно входит один из оптических детекторов или детектор по радиоактивности. Реакционные детекторы позволяют за счет • химических реакций поднять чувствительность детектирования в ЖХ  на несколько  порядков.

В некоторых детекторах используются сразу несколько прин­ципов детектирования, причем такие детекторы можно также раз­делить на две группы: с механическим совмещением нескольких детекторов разных или одинаковых типов в единой конструкции и с регистрацией различных физико-химических явлений в одной ячейке детектора. К первой группе детекторов можно отнести ЭХД с двумя рабочими электродами, один из которых окислитель­ный, а другой восстановительный. Типичными представителями второй группы являются кварцевый флуориметрический—фото­акустический — фотоионизационный детектор или ультрафиоле­товый — электрохимический детектор.

Мультидетектирование является чрезвычайно эффективным методом для идентификации анализируемых веществ, причем сле­дует иметь в виду, что как последовательное, так и параллельное расположение нескольких детекторов в ЖХ не рекомендуется в связи со значительным экстраколоночным размыванием пиков. Существенным недостатком мультидетекторов в ЖХ является пока еще более низкая чувствительность входящих в их состав детекто­ров по сравнению с индивидуальными детекторами.

Использование в качестве детекторов для ЖХ различных при­боров физико-химического анализа, таких как МС, ААС, ПМД, СПФ, ИКС, представляет самостоятельную область исследования.

В хроматографии начинают применяться системы, объединяющие ЖХ с атомно-эмиссиоиными спектрами для детектирования, следов металл-органических соединений Си, Zn, Са, Mg и других металлов в виде, например, халатов. Чувствительность метода на уровне чувствительности УФД при 254 нм. Воспроизводимость 5 ... 20% для проб <20 нг. ЖХ с использованием метода детектирования, специфического для отдельного химического элемента, являет­ся быстрым и воспроизводимым методом анализа, важным средством идентификации следов элемента в химических сое­динениях.

Классификация детекторов в тонкослойной хроматографии

В ТСХ, как правило, используются те же физические и фи­зико-химические принципы детектирования, что и в ЖХ. Сущест­венным отличием является необходимость детектирования пятен на пластинках главным образом после их проявления. С учетом последнего все методы детектирования в ТСХ подразделяют на прямые и косвенные. При прямых методах высоту или площадь хроматографического пика для пятна определяют непосредственно на ТСХ-пластинке, а при косвенных методах —• анализируемое вещество извлекается из пластины путем местной экстракции или механическим снятием сорбента вместе с анализируемым веществом с последующей экстракцией последнего. Косвенный метод по возможностям детектирования более совершенен, чем прямой, однако погрешность предварительной пробоподготовки сильно влияет на результаты всего анализа.

Погрешность измерения прямого метода может быть меньше косвенного, особенно в случае многократного измерения одних и тех же пятен. Здесь используются в основном пять методов: пря­мое измерение площади пятна, оптическая денситометрия, спектро-денситометрия, флуориметрия и радиометрия.

Подразделение денситометрии на оптическую и спектральную достаточно условно, однако широко используется в научной лите­ратуре. Спектроденситометры различаются между собой по способу регистрации потока света: по отражению и по пропусканию. Часто в одном приборе используются оба способа. Спектроденситометры, в отличие от денситометров, позволяют вести измерения на несколь­ких длинах волн или сканировать имеющийся диапазон длин волн.

Косвенные методы детектирования в ТСХ допускают приме­нение всего арсенала используемых в настоящее время в научных исследованиях приборов физико-химического анализа: поляро-графов, поляриметров, флуориметров, рефрактометров, МС и Других. Отдельную группу составляют методы детектирования путем определения биологической активности анализируемых веществ с использованием растений или живых организмов.



 



 

Коллекторы фракций

Коллектор фракций - это прибор, предназначенный для разделения поступающего с колонки элюата на фракции запрогромированног объема (массы). В основном коллекторы фракций используются в связке с жидкостными хроматогрофами и в зависимости от цели хроматографического разделения данные приборы подразделяются на аналитические, полупрепаративные , препаративные и прмышленные. Их принципиальное отличие заключается в максимальном объеме собираемых фракций, что влечет за собой принципиальные отличия в конструкции.

Так аналитические и полупрепаративные КФ представляют собой прибор с ячейками для флаконов (пробирок) в которые собираются фракции и тракта подачи элюата. В зависимости от конструкции для совмещения выхода тракта (капельница) и требуемого флакона существуют приборы как с подвижными ячейками, так и с подвижным трактом (Рис.1). Объем каждой фракции может варьировать от долей миллилитра до десятков миллилитров, их число может доходить до нескольких сотен, а продолжительность сбора одной фракции может составлять минуты или часы — все это ставит перед конструкторами коллекторов непростые задачи по сочетанию вариабельности рабочих параметров с компактностью и надежностью работы прибора. Последнее требование имеет особо важное значение, посквльку коллекторы работают, как правило, без наблюдения за ними (например, в ночное время), а также нередко в условиях повышенной влажности, в холодной комнате.

Рис.1. Аналитический хроматограф низкого давления с коллектором фракций карусельного типа (К).

 Дозировка объема фракций может осуществляться различными способами. Почти вышла из употребления дозировка по суммар­ному объему фракции с помощью сифона (как, например, в простом коллекторе фирмы «ISCO», модель 2111). Стеклянные сифоны хруп­ки и пригодны лишь для сбора относительно больших объемов. Широко распространенная дозировка путем отсчета капель с по­мощью фотоэлемента не отличается точностью (иногда отклонения достигают +20%), поскольку поверхностное натяжение жидкости и объем капли могут изменяться как в ходе элюции за счет смены элюента, так и от опыта к опыту за счет колебаний температуры и давления окружающего воздуха. Дозировка путем отсчета вре­мени с помощью установленного в коллекторе таймера опирается на постоянство скорости подачи элюента насосом. Между тем, эта скорость может изменяться в ходе хроматографического опыта за счет изменения сопротивления колонки. Наиболее совершенным является вариант импульсного управления коллектором (сменой фракций) от перистальтического насоса, исходя из фактической скорости его работы.

  Некоторый минимальный уровень автоматизации, разумеется, предусмотрен даже в самой простой модели коллектора, например задание объема фракций и их числа до автоматической остановки коллектора и насоса или подача отметки на ленту регистратора после каждой смены пробирки (желательно с учетом сдвига по объему между моментом прохождения фракции через кювету детек­тора и ее поступлением в пробрхрку). Удобно, если коллектор снаб­жен цифровым индикатором номера фракции и объема, уже посту­пившего в пробирку. Во многих случаях, особенно при работе с радиоактивно меченными веществами, необходимо, чтобы в коллек­торе было предусмотрено устройство, управляющее клапаном, ко­торый запирает колонку во время смены пробирок. Нелишним явля­ется оснащение прибора «памятью» па случай временного отключения напряжения в сети, с тем чтобы он мог возобновить свою работу с прерванного положения после включения тока. Все электронные управляющие устройства желательно герметизировать для обеспе­чения  стабильной  работы  во  влажной  атмосфере.

 Менее необходимо (по в случае большой загрузки оправдано) использование коллекторов с микропроцессорами и программным управлением. Такие коллекторы, например, могут отбирать только материал, выходящий в составе пиков, и сливать элюепт между ними, собирать четкий одиночный пик в одну пробирку, а плохо разделившиеся пики — в несколько пробирок малого объема. Уп­равление этими операциями происходит в зависимости от амплитуды поглощения света, которую по заданной программе оценивает спе­циальное устройство, именуемое «Level-sensor» («Pharmacia», «LKB») или «Peakdetector» («Gilson»).

В препаративной и промышленной
хроматографии объемы целевых фракций могут измеряться десятками и сотнями литров и поэтому нецелесообразно использовать сложные механические приборы по перемещению больших массивов фракций или тракта с высоким расходом, поэтому в данном случае КФ представляет из себя прибор (часть хроматографа) в котором, поступающий с колонки элюат последовательно перенаправляется при помощи системы клапанов на различные выходы, соединенные с емкостями при помощи гибких шлангов. Циклическое переключение клапанов позоляет заменять заполненные емкости на пустые и собирать неограниченное число фракций. Периодичность переключения клапанов обычно задается при помощи компьютерной управляющей программы.

 

Рис.2 Препаративный хроматограф фирмы Sepragen. На передней панели расположены выходы 10 клапанов коллектора фракций.

 

Колонки

Хроматография осуществляется при прохождении подвижной фазы через слой неподвижной фазы. Самым эффективны, воспроизводимым и удобным в использовании методом хроматографии является метод колоночной хроматографии, в котором неподвижный сорбент находится внутри (заполняет ее или находится на стенках) полой трубки, называемой хроматографической колонкой (далее колонка).
Колонки, как и хроматографические методы, разделяются:

1. По агрегатному составу подвижной фазы: колонки для ЖХ и ГХ;

2. По цели проведения хроматографии: аналитические, полупрепаративные, препаративные и промышленные.

3. По давлению в хроматографической системе: для хроматографии высокого давления (ВЭЖХ-колонки) и для хроматографии низкого давления.

4. По направлению потока подвижной фазы относительно слоя сорбента: аксиальные и радиальные колонки.

5. По расположению неподвижной фазы: полые (капилярные) и насадочные колонки.

Хроматографические колонки для газовой хроматографии

В зависимости от расположения неподвижной фазы колонки
делятся на насадочные (набивные) и капиллярные (Таблица 1).

Таблица 1 − Типы хроматографических колонок.

Тип колонки

Внутренний диаметр dk, мм

Длина Lk, м

Объем Vk, см3

Насадочные

2,0−6,0

0,5−5,0

1,5−141

Микронасадочные

0,5−1,0

0,1−2,0

0,02−1,5

Капиллярные  

0,05−0,5

10−200

0,02−39,2

 

Насадочные (набивные) колонки


Насадочные колонки наполнены адсорбентом (система газ−адсорбент) или инертным твердым носителем, обработанным жидкой неподвижной фазой (система газ−жидкость). Материалом для насадочных колонок является нержавеющая сталь, никель, медь, алюминий, стекло или фторопласт. Металлические колонки отличаются прочностью. Их легко термо-статировать и перед использованием следует тщательно очищать (раствором соляной кислоты, органическими растворителями). Не всегда пригодны для анализа жирных кислот. Медные и алюминиевые колонки используют для анализа углеводородов и других инертных соединений. При анализе полярных соединений возможны адсорбционные и каталитические (как самого металла, так и их оксидов). Медные непригодны для разделения ацетилсодержащих смесей, а алюминиевые
в случае использования молекулярных сит (в качестве адсорбента). Колонки из фторопласта (тефлона) используют для анализа коррозионно-активных веществ и при выполнении анализов на содержание малых примесей высокополярных соединений (вода, аммиак и т.п.) при температуре более 90−100°С. Стеклянные колонки (пирексовские) используют при анализе полярных соединений. Достоинством колонки является возможность визуального наблюдения за состоянием насадки как в процессе набивки, так и в процессе анализа. Недостатком является хрупкость. Эффективность этих колонок зависит от размеров зерен насадки, от способа нанесения НЖФ на твердый носитель и от тщательности на бивки трубки сорбентом. Микронасадочные колонки отличаются от насадочных только длинной и внутренним диаметром трубок (см. табл. 1).

 Капиллярные колонки

Капиллярные  колонки  имеют  неподвижную  фазу,  твердую  либо жидкую, нанесенную в виде тонкого слоя (толщиной максимум несколько мкм) на внутреннюю стенку капилляра, остальное пространство остается полой. Поток  газа движется по  такой  колонке  с большой  линейной скоростью,  не  встречая  значительного  сопротивления.  Несмотря  на большую  длину,  для  обеспечения  необходимых  расходов  газа-носителя через капиллярную колонку оказывается достаточным примерно такое же входное давление, что и при работе с насадочными колонками.
Капиллярные колонки делят на:

−  открытые (незаполненные) (ООК)  − wall-coated open tubular columns (WCOT columns) − классические;
−  открытые с пористым слоем (ОКК-ПС) −  porouslayer open tubular columns (PLOT columns);
−  открытые  с  твердым  носителем (ОКК-ТН) − support-coated open tubular columns (SCOT columns).


Отличительной  особенностью  капиллярных  колонок  является очень высокая эффективность (до нескольких тысяч теоретических тарелок  на 1 м). ООК  используют  для  разделения  многокомпонентной  смесей. Однако  толщина  пленки НЖФ (0,1−0,8  мкм)  не  позволяет  достичь высокой  емкости  колонки  при  анализе  концентрированных  растворов. Нельзя разделить вещества с низкой молекулярной массой или инертных газов при обычных температурах (для этого используют ОКК-ПС и ООК-ТН). ОКК-ПС − это капиллярные колонки, на внутренние стенки которых нанесен слой адсорбента (Al2O3/KCl), молекулярные сита или пористые полимеры (порапак Q). К недостаткам  этих колонок можно отнести −меньшую  эффективность  по  сравнению  с  ОКК-ТН,  невысокую  инертность и снижение стабильности и воспроизводимости во времени. ОКК-ТН − капиллярные колонки, на внутренних стенках которых нанесен  слой  носителя  с НЖФ. Последняя  наносится  на  твердый  носитель, прикрепленный к стенке колонки. Основным достоинством является применение широкого ассортимента НЖФ. Эффективность работы капиллярной колонки в значительной мере определяется чистотой и однородностью внутренней поверхности капилляра. Капиллярные  колонки  изготавливают  из  нержавеющей  стали, меди, стекла или кварца и применяют в  тех случаях, когда на
садочные колонки не позволяют достаточно хорошо разделять компоненты, либо когда для хорошего разделения требуется слишком длительное время. Наиболее широкое распространение получили капилляры из стекла, позволяющие анализировать термически и каталитически неустойчивые,  а  также  высокомолекулярные  соединения.  Стекла (натрий-кальциевые,  боросиликатные)  наиболее  дешевы  и  доступны,  к  тому  же инертнее и стабильнее, чем металлические. К недостаткам относят высокую остаточную  адсорбционную  активность (особенно по  отношению  к полярным соединениям) и низкую механическую прочность. Перечисленные  выше  недостатки  для  стеклянных  колонок  отсутствуют у кварцевых капиллярных колонок. Низкая остаточная адсорбционная  активность  достигается  использованием  химически  чистого SiO2. За счет нанесения на колонку после ее вытяжки внешнего защитного слоя(полиимидного лака, алюминиевого или золотого), предотвращается статическая  усталость  колонки (гидролиз  связи Si−O),  влекущая  за  собой растрескивание  и  ломку  капилляра.  Если  капилляры  защищены  полиимидной пленкой,  то при работе  с ними  нельзя  превышать  температуру300°С.

Формы, установка и соединение колонок.

Колонку  той  или  иной формы  выбирают  в  соответствии  с  размерами  термостата. Наиболее  распространены U-, W-образные  и  спиральные колонки. В хроматографе колонки устанавливаются между дозатором и детектором. Концы колонок должны закрепляться в этих элементах хроматографа  таким  образом,  чтобы  полностью  отсутствовало «мертвое  пространство»,  не продуваемое  газом-носителем.  Следовательно,  в  случае насадочной колонки игла микрошприца должна достигать насадки, а конец  капиллярной  колонки  должен  при  введении  пробы  находиться  на расстоянии 10−15 мм  от  конца  иглы. Выходной  конец  капиллярной  колонки вводится в горелку пламенно-ионизационного детектора непосредственно под форсунку или пропуская через нее на уровень среза пламени, а в случае электронно-захватного детектора — в пространство излучения. Чтобы  не  допустить  утечку  газа,  колонки  крепят  в  приборе  накидными гайками  и  уплотняют  бочкообразными,  коническими,  кольцевыми  или другими прокладками. Металлические колонки можно уплотнять алюминиевыми  прокладками  или  прокладками  из  нержавеющей  стали,  для стеклянных  колонок  рекомендуется  применять  пластиковые  кольцевые прокладки (например, из витона или фторопласта), а при необходимости— из графита. Стеклянные и кварцевые капиллярные колонки уплотняют силиконовой  резиной,  кальрезом,  веспелем  и  прессованной  смесью  графита с фторопластом (графлок). У стандартных инжекторов имеется ввод для иглы, отделенный от атмосферы  дисковой  или  цилиндрической  прокладкой  из  силиконовой резины, которая хотя и не обладает  такой  упругостью,  как  натуральный каучук,  но  зато  имеет  более  высокую  свето-  и  термостойкость.  Такие прокладки выпускаются нескольких типов: для обычных нужд и рабочих температур  до 200°С;  более  упругие  прокладки,  обладающие  большей стойкостью к прокалыванию: прокладки, применяемые при работе с программируемой температурой в случае низкого содержания более летучих олигомеров  и  при  максимальной  температуре 250−300°С;  наконец,  для микроанализа рекомендуется силиконовая прокладка, покрытая политетрафторэтиленовой пленкой. Для работы  при  высоких температурах (выше 300°С) применяют прокладки из эластомера типа политетрафторэтилена (пиросеп S-1). Современные газовые хроматографы позволяют применять одновременно две и более колонки. Колонки можно устанавливать либо параллельно, либо последовательно. В случае параллельного соединения можно получать большую информацию о качестве анализируемого компонента (если в каждой колонке разная неподвижная фаза). Колонки соединяют последовательно при необходимости применения некоторых методик, согласно которым в процессе одного анализа требуется изменять направление потока газа-носителя и вспомогательного газа. Этой цели служит дополнительное оборудование, состоящее из многоходовых кранов или из сдвоенных тройников с подводимыми капиллярными или соленоидными клапанами. В этом случае можно применять метод обратной промывки для быстрого удаления компонентов с большим временем удерживания, либо определять эти компоненты суммарно, либо выделять из всего хроматографического спектра только интересующий нас участок.

Влияние диаметра и формы на эффективность колонки
 
Влияние диаметра набивных колонок на эффективность достаточно четко не выяснено. При аналитических исследованиях хорошим компромиссом являются трубки с внутренним диаметром 2 мм. Змеевиковые наполненные колонки могут иметь низкие характеристики, если отношение диаметра трубки к диаметру змеевика мало. Этот эффект проявляется сильнее для колонок большого диаметра, однако в случае колонок с внутренним диаметром 1−3 мм и обычного диаметра змеевика им можно пренебречь. Характеристика капиллярных колонок является функцией квадрата внутреннего диаметра трубки. Поэтому малые внутренние диаметры, например 0,25 мм предпочтительнее, когда требуется высокая эффективность.
 
Влияние длины на эффективность колонки
 
Минимальная длина колонки определяется числом тарелок, необходимым для получения требуемой степени разделения. Максимальная длина зависит от объема термостата хроматографа и максимально допустимого перепада давления, которое определяется используемым оборудованием. Степень разделения возрастает как корень квадратный из длины колонки; таким образом, длину следует увеличивать в 4 раза, чтобы получить в 2 раза большую степень разделения. Скорость проведения анализов при фиксированной скорости газа-носителя пропорциональна длине колонки. Поэтому предпочтительна колонка минимальной длины обеспечивающая разделение всех интересующих компонентов пробы.


Хроматографические колонки для жидкостных хроматографов

В настоящее время колоночная ЖХ является одним из самых быстроразвивающихся инструментальных методов. Это обусловлено прежде всего тем, что практически любое вещество биологической или неорганической природы может быть растворено в какой-либо жидкости без необратимой потери своих качеств, и, следовательно, все данные вещества могут быть проанализированы и очищены методами ЖХ. Причем относительная простота данного метода позволяет достаточно легко масштабировать любые процессы, т.е. подобрав условия хроматографического разделения на аналитической системе достаточно легко провести аналогичное разделение большего количества того же вещества, пропорционально увеличив объем колонки.  Но для успешного масштабирования необходимо соблюдение нескольких обязательных условий. В частности, для сохранения прежнего хроматографического профиля, кроме всего прочего, качество исполнения колонок должно быть аналогичным. Это достижимо только при стандартизации размеров и их прецизионного исполнения. 

Устройство колонок

В связи с вышеперечисленными методами колонки для жидкостной хроматографии (КЖХ) выполняются из высокопрочных устойчивых к действию агресивных сред металлов (легированной стали, титана и т.д.) или из кварцевого стекла с полированными внутренними стенками. Реже выпускают колонки изготовленные из химически стойких пластиков. Как уже отмечалось, существует множество типов колонок: для хроматографии низкого и высокого давления;  для аналитической, препаративной или промышленной хроматографии; для радиальной или аксиальной хроматографии. Также колонки подразделяют на неразборные  (упакованные в заводских условиях) и  разборные с подвижными и не подвижными адапторами. Каждый тип колонки имеет свои конструкционные особенности. Ниже будут описаны основные составные части  КЖХ и, по возможности,  конструкционные отличия основных типов.
Конструкционно КЖХ состоит из обязательных частей: трубки и адапторов, и не обязательных частей: рубашки термостата, гидравлической системы для упаковки колонки и т.д.

Неразборные колонки

Данный тип колонок в основном используется в аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии, так как данный метод в основном используется для качественного и количественного анализа, при котором особенно важна воспроизводимость результатов. Наилучшим способом достижения данного результата является использование масштабного фабричного поризводства унитарных колонок со строго соблюдаемыми параметрами всех комплектующих. На рынке представлено огромное количество колонок данного типа  различных производителей очень высокого качества, различающимися, главным образом, используемыми в них сорбентами. Не смотря на то, что многие фирмы предлагают примерно одинаковый спектр КЖХ как по физическим размерам колонок, так и по заявленному составу неподвижной фазы, тем не менее именно новшества, привносимые каждой фирмой в производство своих сорбентов иногда приводят к очень значительным различиям по селективности, долговечности и воспроизводимости на конкретных смесях.
Поэтому при подборе ЖКХ для анализа конкретной смеси необходимо:
1) определиться с типом будущего хроматографического анализа (нормальнофазная или обращеннофазная. или ионообменная и т.д.);
2) провести сравнительные тесты колонок различных производителей с выбранным типом сорбента.
Конструктивно данные колонки представляют собой трубки из не подверженных коррозии сплавов (Рис. 1) или пластика в которые запрессован сорбент. С двух сторон колонки имеют резьбовые отверстия с коническим углублением для фитингов. Внутренний диаметр от 1  до 10 мм, длина 10-400 мм.

Рис. 1. Аналитические колонки для ВЭЖХ.


К данному типу КЖХ также можно отнести колонки (картриджи) для проведения двердофазной экстракции и схожие с ними по принципу  картриджи для выделения нуклеиновых килот. Принципиальным отличием данных колонок от применяемых в аналитических хроматогрофах является черезвычайно малое количество (от десятков до сотен миллиграмм) адсорбционного материала, размещенного в ячейке с большим соотношением диаметр/длина. Смыв аналитов с адсорбента осуществляется сравнительно небольшим объемом растворителя (в пределах десяти миллилитров), что дает возможность сильно сконцентрировать аналит, но не позволяет провести полноценную хроматографию.

Разборные колонки

Как ясно из названия колонки данного типа разбираются на составные части: на трубку и адапторы. Это свойство позволяет самостоятельно заполнять колонки  необходимым сорбентом. Практически все колонки для хроматографии низкого давления производятся именно в таком исполнении, как аналитические, так и препаративные. В ВЭЖХ данный вид колонок применяется в высокопроизводительных хроматографах (препаративных и промышленных). Адапторы бывают подвижные и не подвижные, и колонки, в зависимости от исполнения бывают с двумя неподвижными адапторами, с одним подвижным и одним неподвижным адапторам (самая распространенная комплектация) и с двумя подвижными адапторами.

Адапторы

Для удержания сорбента, поддержания постоянного внутреннего объема и создания равномерного и ламинарного потока ПФ через все поперечное сечение колонки используются адапторы.

Подвижные адапторы используются для регулирования внутреннего объема колонки. Принципиальная конструкция подвижного адаптора для аксиальных колонок представлена на риунке 2.


Рис. 2. Конструкция   адаптера. 1 — корпус; 2 — фильтр (мембрана); 3 — прижим; 4 — уплотнительное кольцо; 5 уплотнение трубки; 6 — гайка при­жима;   7— трубка для поступления (выхода) ПФ.

Материалы колонки

Материалы из которых выполнены составные части адаптора различаться могут сильно различаться в зависимости от цели и условий хроматографии. Так при ВЭЖХ практически все части как адапторов (даже мембрана), так и колонки выполняются из металла. При хроматографии низкого давления колонка зачастую выполняется из стекла, а детали адаптора из химически стойкой пластмассы (полиэтилена, тефлона и т.д.).

Набивка колонки

Набивка колонки - очень ответственный процесс, от качества выполнения которого практически полностью зависит успех дальнейшего эксперимента. Основной опасностью при набивке являются неоднородности, которые могут образоваться по разным причинам и привести к размыванию пиков и, в конечном итоге, к неудовлетварительному результату хроматографии. Неоднородности могут образовываться от:

1) неравномерного заполнения колонки в результате слишком быстрого осаждения сорбента или неравномерности осаждающего потока;

2) посторонних включений в сорбент (пузырьки воздуха, грязь, колонии микроорганизмов и т.д.);

3) неоднородности размеров гранул сорбента.

Для недопущения неравномерного заполнения колонки необходимо заполнять колонку однородной, свежеприготовленной  суспензией постепенно добавляя новые порции суспензии до заполнения сорбентом требуемого объема колонки, после этого следует установить верхний адаптор не допуская образования пузырьков воздуха и пустить поток подвижной фазы для окончательного осаждения сорбента. Следует отметить, что для достижения нужного результата обязательным условием является чистота мембран и одинаковая проницаемость по всей площади.

Посторонние включения такие как грязь и колонии микроорганизмов образуются в результате неправильных условий хранения или неправильной регенерации сорбента и предупреждаются только полным соблюдением регламента или заменой сорбента. Пузырьки воздуха могут образовываться в двух случаях: при слишком интенсивном суспензировании или при неаккуратном вливании суспензии в колонку. В обоих случаях происходит расплескивание суспензии и таким образом происходит захват трудноотделимых пузырьков. Зачастую, в данном случае необходимо перенабивать колонку.

Неоднородноти размеров гранул встречаются при использовании сорбентов старых марок, экспериментальных сорбентов или использованных ранее сорбентов, в которых присутствует мелкодисперсная фракция разрушенных гранул. При всех приведенных случаях необходимо производить отмучивание (декантацию) суспензии.  Для этого разбавленную суспензию набухшего, промытого и переведенного в нужный буфер (см. ниже) сорбента заливают до­верху в мерный цилиндр, объем которого в 5—6 раз больше, чем объем упакованного влажного сорбента, и дают ему осесть до того момента, когда между слоем сорбента и мутной жидкостью над ним обозначится резкая граница. Гранулы смолы или сефадексов оседают относительно быстро — за несколько минут (в зависимости от их среднего размера), а целлюлоза — медленнее (за 10—30 мин). Жид­кость над осадком вместе со взвешенными в ней мелкими частицами отсасывают и отбрасывают. Снова дополняют цилиндр буфером, осторожно палочкой взмучивают осадок по всему объему цилиндра и повторяют описанную операцию до тех пор (3—5 раз), пока жид­кость над только что образовавшимся осадком не будет совершенно прозрачной. Затем выжидают еще некоторое время (до полного осе­дания слоя сорбента), измеряют его высоту линейкой и отсасывают буфер — на этот раз не полностью, а до такого уровня, чтобы слой жидкости составлял половину высоты осадка. Такое соотношение при взмучивании позволяет получить кашицу («slurry»), консистен­ция которой наиболее удобна для заливки в колонку.

В преперативной хроматографии (особенно ВЭЖХ) для забивки колонки используют гидравлические системы, позволяющие равномерно уплотнять сорбент и удерживать его в заданном объеме во время хроматографии. В этом случае, для достижения оптимального результата необходимо строго придерживаться руководства производителя по используемому при упаковке давлению на сорбент. В случае отклонений от заданных условий упаковки может произойти или пережатие сорбента (при превышении давления), или образовываться полотсти (при меньшем давлении).

Классификация колонок для ВЭЖХ (по данным ф. Аквилон)

В зависимости от площади поперечного сечения и длины колонки можно разделить на макромасштабные препаративные, препаративные, полупрепаративные, стандартные аналитические колонки, микроколонки и капиллярные колонки.

 

Колонки для радиальной хроматографии

Рис.3. Колонка для радиальной хроматографии фирмы Sepragen

Колонки для радиальной хроматографии конструкционно отличаются от описанных выше коаксиальных колонок. В данном типе колонок слой сорбента представляет собой "трубку" и поток ПФ направлен с наружной поверхности данной "трубки" и элюируется внутри "трубки".  Такая конструкция значительно  сложнее  применяемой  в коаксиальной  колонке,  но  за счет значительно увеличенной площади внешней мембраны можно значительно увеличить скорость нанесения, а за счет значительно меньшей площади выходной мембраны при элюции адсорбат концентрируется, что требуется при многих биотехнологических процессах. Еще одним достоинством данной конструкции является легкость масштабируемости. Для моделирования данного процесса можно использовать сектор пропорциональный колонке

 

 



Масс-спектрометры

Масс-спектрометры выделены в отдельный раздел, т.к. могут использоваться как в качестве самостоятельного прибора, так и в качестве детектора в хроматографии. Масс-спектрометр является исключительным важным прибором для идентификации молекул путем измерения отношения их массы к заряду m/z в ионизированном состоянии. Он особенно по­лезен  для обнаружения и анализа макромолекул в следовых количе­ствах менее 1 пг (10~12 г). Принципиальная схема устройства масс-спектрометра включает в себя инжектор (дозатор) проб, ионизатор, анализатор масс и детектор ионов (рис. 1). Сначала проба впрыски­вается в ионизатор, где молекулы образца ионизируются. Затем ионы образца анализируются и регистрируются. Чтобы предотвратить стол­кновение с молекулами газа, ионизатор, анализатор масс и детектор ионов обычно работают в вакууме.

Рис. 1. Принципиальная схема масс-спектрометра.
Способность масс-спектрометра разделять ионы описывается ве­личиной R, которая называется разрешающей способностью (или разре­шением), она определяется как:

R=M/Дт
где M — масса иона, а Дт — разность масс между двумя различимыми пиками. Область значений R обычно находится в интервале между 100 и 500 000.
В соответствии с конструкцией анализатора масс существуют пять ос­новных типов масс-спектрометров (МС):
 
1)  секторные магнитные и (или) электрические МС (рис. 2 и 3);
2) квадрупольные МС (рис. 4);
3) МС с ионной ловушкой (рис. 5);
4)  время-пролетные МС (рис. 6-7);
 

5) МС с преобразованием Фурье (рис. 8).

Времяпролетные масс-спектрометры (ВП-МС) обычно менее до­рогие, чем другие типы масс-спектрометров. По сравнению с квадру-польными МС и многими секторными МС они обладают тем пре­имуществом, что регистрируют массы всех ионов без сканирования, что способствует их высокой чувствительности. Однако у ВП-МС меньшая разрешающая способность и меньший интервал регистри­руемых масс, чем у масс-спектрометров с преобразованием Фурье (МС-ПФ).

Рис. 2. Одиночный магнитный или электрический сектор масс-спект­рометра с одноканальным (а) и многоканальным (б) детекто­ром. Ионы, покидающие источник ионов, ускоряются и про­ходят через сектор, в котором магнитное или электрической» поле прикладывается перпендикулярно к направлению их дви­жения. Поле изгибает траекторию полета ионов и принуждает ионы с различным отношением m/z разлетаться веером. В ска­нирующем анализаторе масс (а) изменяют силу электрическо­го или магнитного поля, при этом каждый раз регистрируется только одна масса. В несканирующем анализаторе (б) все мас­сы регистрируются одновременно (в определенном диапазоне масс) с помощью многоканального детектора.

Рис. 3. Настольный односекторный масс-спектрометр (GCmatell от JEOL Ltd., Токио; Matsuda, 1976, 1981; Matsuda et al., 1974). Схема ионной оптики с высоко эффективной транмиссией.

Рис. 4. Квадрупольный масс-спектрометр. Пучок ионов с помощью элек­трического поля разгоняется до высокой скорости и проходит сквозь квадрупольный анализатор масс, состоящий из четырех металлических стержней. К этим стержням прилагается напря­жение постоянного или переменного тока таким образом, что в каждый момент времени сквозь анализатор пролетают ионы толь­ко с одним соотношением массы к заряду — m/z- Чтобы просканировать различные m/z, напряжение тока варьируют.

Рис. 5. Анализатор масс с ловушкой ионов. С помощью различных высокочастотных сигналов, которые прилагаются к кольцево­му электроду и концевым заглушкам, все ионы улавливаются в полости и затем последовательно испускаются соответственно величине их отношений m/z..Динод [от греч . dyn(amis) — сила и (электр)од], электрод в фотоэлектронномумножителе, обладающий высоким коэффициентом вторичной электронной эмиссии.
Времяпролетные (Распространено написание как с дефисом: время-пролетные, так и слитное: времяпролетные) масс-спектрометры отличаются тем, что в них с по­мощью, например, импульса ионизирующего лазера (рис. 6) или с помощью импульса высокого напряжения в электрическом затворе ионы стартуют в одно и то же время. После прохождения через ускоряющую разность потенциалов ион с зарядом z, массой т и скоростью v при­обретает кинетическую энергию Е:
Е=zV=mv2/2

 

Рис. .6. Линейный времяпролетный масс-спектрометр (ВП-МС) с ла­зерной десорбционной ионизацией на матрице (ЛДИМ). Ли­нейная конфигурация ВП-МС представляет простейший ва­риант времяпролетной техники. Типичный диапазон масс ле­жит между 0 и 100 кДа, и типичное разрешение масс R составляет 300—200.

К сожалению, не все ионы стартуют в одно и то же время и не все ионы имеют одну и ту же скорость. Разница в скоростях называется хроматической аберрацией. В простой линейной конст­рукции ВП-МС из-за хроматической аберрации и различий в старто­вом времени очень трудно обеспечить требования, необходимые для высокого разрешения (рис. 6). В отражательном (рефлектронном) ВП-МС (рис. 3.7) ионная оптика обращает направление движе­ния ионов и тем самым снижает хроматическую аберрацию.

Рис. 7. Времяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения с рефрактометром.

 
Рис. 8. Принцип работы масс-спектрометра с преобразованием Фу­рье (МС-ПФ). Другое его название: «ион-циклотрон-резонан­сный масс-спектрометр» :
а — ионы впрыскиваются (инжектируются) в ячейку анализатора. Маг­нитное поле вынуждает тепловые ионы вращаться по низким орби­там, радиус которых зависит от отношения массы ионов к их заряду m/t, 6 — прилагаемые высокочастотные импульсы резонансно пере­двигают ионы на более высокие орбиты; в — высокочастотный сиг­нал, порождаемый принудительным вращением ионов, измеряется и подвергается Фурье-преобразованию. Замечательной особенностью МС-ПФ является высокое разрешение (Л), которое обычно превышает 100000.
Существенное улучшение информационного содержания спектров до­стигается фрагментацией образца, которое можно осуществить, напри­мер, в ионизационной камере (рис. 9) или в полости ионной ло­вушки анализатора масс, заполненной инертным газом, например аргоном.

Рис. 9. Секторный масс-спектрометр высокого разрешения с иониза­ционной камерой.
 
Для исследования высоко сложных биосистем, таких как целые клет­ки, масс-спектрометрия часто комбинируется с хроматографическими методами, например как высокоэффективная жидкостная хроматогра­фия (ВЭЖХ) или газовая хроматография (ГХ). В результате получаются двухмерные спектры. При этом значительно усиливается разрешающая способность анализа сложных смесей с большим числом компонентов. Если, например, ионообменная хроматография сырых клеточных экстрактов имеет раз­решение R = 100, а разрешение масс-спектрометра составляет R = 10 000, то их комбинация может дать разрешение R = 1 000 000 для не­больших и среднего размера клеточных белков, для которых результа­ты обоих методов обычно не зависят друг от друга.
Влияние буферных растворов, которое иногда наблюдается при масс-спектрометрии, обычно удается снизить, если увеличить концен­трацию образца, уменьшить концентрацию буфера или сменить буфер.

Насосы

Как указывалось ранее при хроматографическом разделении обязательным условием является наличие подвижной и неподвижной фаз. Для воспроизводимости результатов хроматографических исследований, как и всех других экспериментов, необходимо постоянство условий проводимого эксперимента, в том числе и скорости подвижной фазы.
 
В газовой хроматографии для достижения необходимого расхода ПФ используются баллоны с высоким давлением, редукторы и расходомеры.
 

В жидкостной хроматографии используют множество типов насосов. При ЖХ низкого  давления зачастую используют перистальтические насосы (Рис.1).

Рис.1 Програмируемый перистальтический насос MasterFlex.

При ВЭЖХ для обеспечения расхода подвижной фазы через колонку с указанными параметрами используются насосы высокого давления.

К наиболее важным техническим характеристикам насосов для ВЭЖХ относятся: диапа­зон расхода; максимальное рабочее давление; воспроизводимость расхода; диапазон пульса­ций подачи растворителя.

По характеру подачи растворителя насосы могут быть постоянной подачи (расхода) и постоянного давления. В основном при аналитической работе используется режим постоян­ного расхода, при заполнении колонок - постоянного давления.

По принципу действия насосы для ВЭЖХ делятся на шприцевые и на плунжерные возвратно-поступательные.

               

Шприцевые насосы

Основной отличительной особенностью данных насосов является цикличность их работы, в связи с чем хроматографы, в которых применяются данные насосы, также отличаются цикличностью работы.


Рис. 2. Принципиальное устройство шприцевого насоса для ВЭЖХ.


Рис. 2А. Шприцевой насос.

Блок управления БУ подает напряжение на двигатель Д, определяющее скорость и направление его вращения. Вращение двигателя с помощью редуктора Р преобразуется в пе­ремещение поршня П внутри цилиндра Д. Работа насоса осуществляется в 2 цикла. В цикл заполнения клапан К2 закрыт, К1 - открыт, растворитель поступает из резервуара в цилиндр Ц. В режиме подачи клапан К1 закрыт, а через клапан К2 подвижная фаза поступает в дози­рующее устройство.

Для насосов этого типа характерно практически полное отсутствие пульсаций потока подвижной фазы в ходе работы.

Недостатки насоса:

а)  большой расход времени и растворителя на промывку при смене растворителя;

б) ограниченный объемом шприца объем ПФ, а следовательно ограниченное время разделения;

в) приостановка разделения во время заполнения насоса;

г) большие габариты и вес при обеспечении большого расхода и давления (нужен
мощный двигатель и большое усилие поршня с его большой площадью).

 

Плунжерные возвратно-поступательные насосы.

 

Рис. 3. Принципиальное устройство плунжерного насоса.

Принцип действия.
Двигатель Д через редуктор Р приводит в возвратно-поступательное движение плун­жер П, перемещающийся в рабочей головке насоса. Клапаны К1 и К2 открываются, когда на­сос находится в фазе всасывания и подачи соответственно. Величина объемной подачи опре­деляется тремя параметрами: диаметром плунжера (обычно 3.13; 5.0; 7.0 мм), его амплитудой (12-18 мм)и частотой(что зависит от скорости вращения двигателя и редуктора).

Насосы этого типа обеспечивают постоянную объемную подачу подвижной фазы длительное время. Максимальное рабочее давление 300-500 атм, расход 0.01-10 мл/мин. Воспроизводимость объемной подачи -0.5%. Основной недостаток - растворитель подается в систему в виде серии последовательных импульсов, поэтому существуют пульсации давле­ния и потока (Рис.4). Это является основной причиной повышенного шума и снижения чувствитель­ности почти всех детекторов, применяемых в ЖХ, особенно электрохимического.

 


 

Рис.4. Пульсации плунжерного насоса.

 

Способы борьбы с пульсациями.

1. Применение демпфирующих устройств.

Это спиральные трубки специального профиля из нержавеющей стали, включенные последовательно или параллельно в систему между насосом и дозатором.


Рис. 5. Спиральный демпфер.
 
Демпфер раскручивается при увеличении давления в нем (ускорение хода насоса). При спаде давления он скручивается, его объем уменьшается, он выдавливает из себя часть растворителя, поддерживая постоянным расход и уменьшая пульсации. Такой демпфер хо­рошо работает при давлении 50 атм и выше.
При давления 5-30 атм лучше сглаживает пуль­сации воздушный демпфер, изготовленный из колонки (рис. 6.). Воздух в заглушенной ко­лонке (6х200 мм) сжимается и пульсации гасятся. Воздух в нем растворяется за 24 часа.

 

Рис. 6. Воздушный демпфер.
 
2. Применение электронных устройств.
При использовании электронного датчика давления можно использовать показания датчика для управления работой насоса. При спаде давления увеличивается скорость враще­ния двигателя и компенсирует уменьшение давления. Также можно скомпенсировать утечки в клапанах и частично в манжетах. Применение электронного демпфера (БПЖ-80, ХПЖ-1 и т.д.) позволяет снизить пульсации давления до 1 атм при давлении 100-150 кгс/см2.
 
 

Принципиальное устройство газового хроматографа

 

 

 

 

 

Рис 1. Схема хроматографа. 1. Баллон с газом носителем (азот), 2. Баллон с водородом, 3. Баллон со сжатым воздухом, 4. Редукторы, 5. Капиллярная газовая линия газа носителя, 6. Капиллярная газовая линия водорода, 7. Капиллярная газовая линия сжатого воздуха, 8. Регуляторы рабочего давления газов, 9. Манометры рабочего давления газов, 10. Газовый блок хроматографа, 11. Подающий капилляр водорода, 12. Подающий капилляр сжатого воздуха, 13. Подающий капилляр газа носителя, 14. Блок автоматической регулировки температуры термостата, 15. Нагревательный элемент термостата, 16. Капиллярная колонка, 17. Устройство ввода анализируемого материала в хроматограф, 18. Испаритель, 19. Горелка, 20. Ионизационно-пламенный детектор, 21. Коаксиальный кабель, 22. Измеритель малых токов, 23. Компьютер.

 

Принципиальное устройство жидкостного хроматографа

Самыми распространенными хроматографическими системами являются системы, имеющие модульный принцип сборки. Насосы, дегазирующие устройства, детекторы, дозаторы (автосамплеры), термостаты для колонок, коллекторы фракций, блоки управления хроматографической системой и регистрирующие устройства выпускаются в виде отдельных модулей. Широкий выбор модулей позволяет гибко решать различные аналитические задачи, быстро менять при необходимости конфигурацию системы с минимальными расходами. Вместе с тем выпускаются и мономодульные (интегрированные) ЖХ, главным преимуществом которых является миниатюризация отдельных блоков, компактность прибора.

В зависимости от способа элюирования жидкостные хроматографы делятся на изократические и градиентные.

 Схема изократического хроматографа

 

 

Подвижная фаза из емкости (1) через входной фильтр (9) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Далее, через in-line фильтр (8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило насоса или системного контролера), с клавиатур каждого из модулей системы или производиться управляющей программой с персонального компьютера.
В случае градиентного элюирования используются два принципиально различных типа жидкостных хроматографов. Они отличаются точкой формирования градиента состава подвижной фазы.

Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии низкого давления.

 

Подвижная фаза из емкостей (1) через входные фильтры (9) и программатор градиента (10) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой клапанов программатора градиента управляет либо управляющий модуль системы (насос или контроллер), либо управляющая программа ПК. Системы такого типа формируют бинарный, трехмерный и четырехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр (8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.
Несмотря на кажущуюся привлекательность таких систем (в них используется всего лишь один прецизионный насос высокого давления), данные системы обладают рядом недостатков, среди которых основным, пожалуй, является жесткая необходимость тщательной дегазации компонентов подвижной фазы еще до смесителя низкого давления (камеры программатора градиента). Она осуществляется с помощью специальных проточных дегазаторов. Из-за этого факта стоимость их становится сравнимой с другим типом градиентных систем - систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления.
Принципиальным отличием систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления является смешение компонентов в линии высокого давления, естественно, что при данном подходе количество прецизионных насосов определяется количеством резервуаров для смешивания подвижной фазы. При таком подходе требования к тщательности дегазации компонентов существенно снижаются.
 

Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии высокого давления.

Подвижная фаза из емкостей (1) через входные фильтры (9) подается прецизионными насосами высокого давления (2 и 11) через статический или динамический смеситель потока (10) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой управляемых насосов управляет либо управляющий модуль системы (насос “master pump” или контроллер), либо управляющая программа ПК. В этом случае все насосы являются управляемыми. Системы такого типа формируют бинарный или трехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр(8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.
Предложенные схемы являются достаточно упрощенными. В состав систем могут быть включены дополнительные устройства - термостат колонок, системы постколоночной дериватизации, системы пробоподготовки и концентрирования образца, рециклер растворителя, мембранные системы подавления фоновой электропроводности (для ионной хроматографии), дополнительные защитные системы (фильтры, колонки) и т.д. На схемах, также отдельно не показаны манометрические модули. Как правило, эти устройства встраиваются в насосные блоки. Эти блоки могут объединять в себе несколько насосов, насос с программатором градиента, а также общий системный контроллер. Структура системы зависит от ее комплектации и каждого конкретного производителя.

Такое радикальное усложнение технического сопровождения хроматографического процесса приводит к возникновению ряда требований к свойствам подвижной фазы, отсутствующих в классической колоночной и планарной хроматографии. Жидкая фаза должна быть пригодна для детектирования (быть прозрачной в заданной области спектра или иметь низкий показатель преломления, определенную электропроводность или диэлектрическую проницаемость и т.д.), инертна к материалам деталей хроматографического тракта, не образовывать газовых пузырей в клапанах насоса и ячейке детектора, не иметь механических примесей.

 

Устройства ввода пробы

Ввод пробы в хроматографическую систему является первым этапом хроматографического разделения и от того насколько качественно будет выполнен данный  технологический процесс во многом зависит и результат хроматографии.

В хроматографии ввод пробы осуществляется или вручную, или автоматически при помощи специального прибора, автосемплера.

Ручной ввод пробы

Данный метод в основном применяется в устаревших или недоукомплектованных автосамплерами аналитических хроматографических системах, а также в препаративных и промышленных хроматогрофах. В первом случае для внесения пробы используют т.н. "гамильтоновский шприц" (шприц), представляющий собой прецезионно выполненную стеклянную градуированную трубку с поршнем и длинной иглой из нержавеющей стали (Рис.1).

Рис.1. Гамильтоновские шприцы.

Высокое качество исполнения и широкий диапазон объемов позволяют с точностью до 0,1 мкл вводить аликвоты от 1 до 100 мкл. Также следует отметить высокую надежность и неприхотливость данных устройств, что побуждает некоторых специалистов отказываться от использования дорогостоящих, но иногда не предсказуемых или сбоящих, приборов автоматического ввода пробы - автосамплеров или использовать шприцы для поверки точности вкола автосамплеров.

Использование в препаративной жидкостной хроматографии ручного ввода обусловлено прежде всего большими объемами наносимой пробы, измеряемой иногда сотнями литров. Поэтому, для осуществления данного процесса в препаративной хроматографии используются или основные насосы, или специальный насос для ввода пробы, которыми оператор управляет в ручном режиме.

Автоматический ввод пробы

Для атоматического ввода пробы используется автосамплер - прибор, предназначенный для автоматической подачи запрограмированного объема пробы в хроматографическую систему. Данные приборы используются в аналитических и полупрепаративных хроматографических системах и позволяют значительно ускорить проводимые исследования, обеспечивая автоматическую подачу серий анализируемых образцов. Тем самым значительно облегчется работа хроматографиста и повышается воспроизводимость результатов из-за исключения человеческой ошибки. 



Рис.2 Принципиальная схема автосемплера, где: 1-флаконы (виалы) с пробами, 2 - игла для отбора проб, 3 - гамильтоновский шприц, 4 - распределительный 6-ти клапанный кран.

На рисунке представлена принципиальная схема автосамплера в котором, из находящегося в ячейке флакона с анализируемой пробой, адрес которой задан управляющей программой,  при помощи иглы для отбора проб отсасывается аликвота заданного программой объема и поступает в магистраль хроматографа при помощи распределительного 6-ти клапанного крана. При этом объем отбираемой аликвоты контролируется гамильтоновским шприцем, поршень которого приводится в движение прецезионным двигателем.

На практике автосамплеры могут конструктивно значительно отличаться. Так существуют автосамплеры: с лотком для флаконов как карусельного (Рис. 3), так и ортогонального типов, с термостатируемым или нет лотком для флаконов, с возможностью предварительного смешивания содержимого нескольких флаконов или без оной и т.д. И поэтому, при выборе конкретной модели следует отталкиваться от объекта исследований.

Рис.3. Атосамплер карусельного типа. Видны флаконы с пробами и игла для отбора проб.

 

Литература

  1.  Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - Л.А. Остерман, М., Наука, 1985 г. 
  2.  Практическая  газовая хроматография: Учебно-методическое пособие для студентов химического факультета по спецкурсу «Газохроматографические методы анализа».—Царев H.И.,  Царев  В.И.,  Катраков  И.Б.,  Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2000. − 156 с. 
  3. Количественная газовая хроматография для лабораторных анализов и промышленного контроля: В 2-х частях, ч. II: Пер. с англ. — Гиошон Ж., Гийемен К. М.: Мир, 1991. —375 с. 
  4. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии - Рудаков О.Б. и др., Воронеж, Водолей, 2004 г. 
  5. Детекторы   для хроматографии. — Бражников В. В.М.: Машиностроение. 1992.
  6. Новейшие методы исследования бисистем. - Б.Нолтинг, М.:Техносфера, 2005 г. 
  7. Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн. 1 Общие вопросы. Методы разделения: Учебник для ВУЗов. - Ю.А. Золотов, Е.Н. Дорохова, В.И. Фадеева и др.; Под ред. Ю.А. Золотова. - М.: Высш. шк., 1996. 
  8. Википедия. 

Видео лекций по теории хроматографии

Привожу один (точнее один цикл) из немногих обучающих роликов в Youtube на русском языке, что, конечно, очень удручает, т.к., например, на испанском их тьма-тьмущая, не говоря уже про английский. Данный цикл я советовал-бы посмотреть тем, кто хочет, наконец-то понять, что это такое и для чего хроматография нужна, а также для освежения знаний по теории и истории хроматографии.

 

Курс хроматографии, лекция 1, часть 1

Курс хроматографии, лекция 1, часть 2

Курс хроматографии, лекция 1, часть 3

Курс хроматографии, лекция 1, часть 4

Курс хроматографии, лекция 1, часть 5

Курс хроматографии, лекция 1, часть 6

Курс хроматографии, лекция 1, часть 7

Курс хроматографии, лекция 1, часть 8

Курс хроматографии, лекция 1, часть 9

 

Удручает, естественно, качество самого ролика (уж очень любительское: иногда очень плохо слышно, а на доске видны одни блики), а также уровень преподавания. Педагог,  старается, но это-же не математика, для преподавания которой учителю ни чего кроме таланта, мела и доски не нужно, а очень солжный инструментальный метод, где наглядность просто необходима.  Слабым оправданием может служить только то, что курс, видимо, читается для "галочки" в каком-то не профильном ВУЗе. С другой стороны что имеем, то и имеем. Меня, в принципе, тоже, примерно, так учили замечательные, хочу заметить, преподаватели, но природу не обманешь и раз давали только теоретические знания, то только с теорией я из ВУЗа и вышел, о чем жалею. Надеюсь у кого-то лекции проходили намного интереснее, так что надеюсь скоро увидеть более качественное видео с более интересной подачей материала.