Определение мертвого объема колонки. Рассмотрение возможности применения ацетонового теста для обращенно-фазных колонок.

Исходные данные эксперимента
Использованное оборудование: 
Прибор: жидкостной хроматограф фирмы Dionex UltiMate 3000 в составе: автосемплер - WPS-3000; насос – LPG-3400A; термостат - TCC-3000; UV-детектор - VWD-3100; Колонка Acclaim 120 C18 150×2,1 mm.

У хроматографической колонки существует несколько параметров, которые желательно как контролировать при покупке, так и при подозрении на ее повреждение во время работы. Некоторые из них , такие как: "мертвый объем", качество и эффективность набивки хроматографической колонки - легко можно оценить по форме пика неудерживаемого в используемой хроматографической системе вещества, пропущенного через колонку.

Таким образом используемое вещество должно обладать несколькими важными свойствами:

1. Быть хорошо растворимым в подвижной фазе

2. Уверенно регистрироваться детектором

3. Быть низкомолекулярным.

 4. Не сорбироваться на поверхноти сорбента.

В настоящее время в подавляющем большинстве большинстве жидкостных хроматографов оборудовано (спектро)фотометрическим UV-детекторами. В результате наиболее распространенны тесты с использованием веществ, интенсивно поглащающих в УФ-диапазоне: ароматические, с сопряженными двойными связями и т.д. В зависимости от тестируемой хроматографической системы данные вещества также должны обладать разными физико-химическими свойствами. Так при нормально-фазной хроматографии необходимо использовать что-то очень не полярное (например, бензол, нафталин и т.д.), а при работе с обращенно-фазными колонками необходимо наоборот использовать что-то очень полярное, например, как советует NIST - азотистое основание урацил (смотри в приложенном PDF-файле). При тестировании колонок с сорбентами на основе гидрофильных полимерных волокон (Сефадекы, Сефарозы и т.д.) используют 1-5% водный раствор ацетона. Следует помнить, что в связи с отсутствием взаимодействия аналита с сорбентом хроматографическое разделение будет происходить по гель-фильтрационному механизму в связи с чем объем вводимой пробы не должен привышать 1-2% от полного объема колонки.

Но одно дело стандартные процедуры, для проведения которых необходимы высокоочищенные реактивы и приведение колонки в стандартное состояние (переуравновешивание) для проведения анализа, что не всегда удобно, да и в реальной лаборатории часты случаи, когда стандартных реактивов нет и приходиться спасаться "подручными средствами". В результате существуют различные способы определения мертвого объема с успехом заменяющие стандартизованные.

Так при тестировании обращенно-фазных колонок иногда используют:

1. неорганические соли: нитраты, бромид и т.д., регистрируя сигнал на 210 нм. (Где-то слышал, в форумах читал упоминания, но сам методику найти не смог, так что если ссылку дадите, буду признателен).

2. Проводят ацетоновый тест по вышеприведенной методике.

О нем же я и хочу поговорить более подробно. Сам я уже писал про его проведение в нескольких более ранних своих записях:

http://www.chromatogramma.ru/blog/2009/11/21/atsetonovyi-test-na-vezhkh-khromatografe-varian.html

http://www.chromatogramma.ru/blog/2009/10/20/ego-velichestvo-atsetonovyi-test.html

Все данные записи основаны на моих достаточно ранних и довольно безсистемных наблюдениях, выводы из которых иногда были достаточно неоднозначными. Теперь у меня наконец-то появилось некоторое время чтобы разъяснить для себя один очень частный случай: возможно-ли использовать водный раствор ацетона при определении мертвого объема обращенно-фазовой колонки с привитой фазой C18 в водно-ацетонитрильной подвижной фазе?

Для этого я, на приведенном выше оборудовании, производил вколы 1% ацетона при разных соотношениях ацетонитрила и воды в подвижной фазе. Каждый анализ производился на предварительно уравновешенной колонке. Объем вкола 2 мкл. Скорость потока 0,4 мл/мин. Температура колонки 30°С. Детекция на 280 нм.  Результат приведен на рисунке 1.

 

 Рисунок 1. Сравнение хроматограмм, полученных при проведении "ацетонового теста" колонки при использовании различных соотношений ацетонитрил/вода в подвижной фазе: голубой цвет (закрашенный пик) -10% ацетонитрила, салатовый -20% ацетонитрила, коричневый -30% ацетонитрила, розовый -50% ацетонитрила, синий -80% ацетонитрила, черный -100% ацетонитрила.

 Прекрасно видно, что ацетон прекрасно удерживается на колонке за счет гидрофобных взаимодействий, что демонстрируется тем, что с увеличением содержания растворителя время его удержания, а также емкость пика k' падает. Причем при максимальных значениях концентрациях ацетонитрила (80 и 100%) время его выхода практически не изменилось и составило 1,47 мин или 0,59 мл. Стоит отметить, что при 100% ацетонитрила ацетон, почему-то, вышел 2 пиками: тут я теряюсь в догадках:). Тем не менее по паспорту (рисунок 2) на колонку объем колонки составляет t(uracil)*v= 1,49*0,21=0,31 мл, что значительно меньше 0,59 мл.

Рисунок 2. Паспорт на колонку Acclaim 120 C18

Можно, конечно, предположить, не смотря на заявления NIST, что урацил "слишком большой" и за счет эффекта эксклюзии не попадает в поры, а ацетон везде "проходит", но в даже в этом случае V0 не может быть больше внутреннего объема трубки колонки, который равен 0,52 мл. Таким образом показано, что водный раствор ацетона не подходит для определения мертвого объема обращенно-фазовой колонки с привитой фазой C18 в водно-ацетонитрильной подвижной фазе, т.к. ацетон, в данных условиях, удерживается на колонке.

Хочу добавить, что при тестировании обращенно-фазовой колонки с привитой фазой C4  в водно-ацетонитрильной подвижной фазе тоже происходило удерживание ацетона, но в том случае исследования во всем диапазоне соотношений не проводились и, возможно, за счет меньшей гидрофобности неподвижной фазы, при каком-то соотношении ацетонитрил/вода данный подход возможен.

 В результате вывод: надо покупать урацил :(, что обидно, так, как ацетон есть везде, а урацил покупать надо.

Хотя вопрос использования ацетона для определения мертвого объема в ОФ колонках с C18 еще не закрыт, так на курсах ВЭЖХ в Спектронике (да, я там был:) нам на лекции сказали, что они (ХимФак МГУ, между прочим:) мертвый объем определяют методом ацетонового теста с использованием 100% метанола в качестве подвижной фазы. Хотя я не знаю, что выгоднее и менее энергозатратно у нас в России: купить урацил или метанол для ВЭЖХ, который жуткий прекурсор, но если появится, обязательно проверю.

Все рассчеты и данные по экспериментам приведены в приложенном XLS-файле.

Всем желаю хороших выходных.

 

Прикрепленный файлРазмер
NIST Test for HPLC Packing Characterization на стр 7.pdf515.13 кб
aceton.xls30 кб

О пользователе

Василий аватар
User offline. Last seen 3 недели 5 дней ago. Не в сети
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Зарегистрирован(а): 20/05/2009