Влияние ТФУ на разделение белков при ОФ ВЭЖХ

Исходные данные эксперимента
Использованное оборудование: 
Прибор: жидкостной хроматограф фирмы Dionex UltiMate 3000 в составе: автосемплер - WPS-3000; насос – LPG-3400A; термостат - TCC-3000; UV-детектор - VWD-3100; Колонка Acclaim 120 3мкм C18 150×2,1 mm.

При обращенно-фазовой ВЭЖ хроматографии белков в качестве модификатора очень часто используется трифторуксусная кислота в концентрациях от 0,05-0,2% по массе. С одной стороны кислота выступает в качестве протонирующего агента, а с другой - как ион-парный агент, улучшающий разделение. При отработке условий разделения белковой смеси на новой колонке использовалась тестовый раствор белков. Был поставлен эксперимент по определению зависимости разрешения пиков примесных белков от концентрации ТФУ от 0,05% до 0,3% с шагом 0,05%.

Рис. 1 Сравнение хроматограмм разделения тестовой смеси белков при различных концентрациях ТФУ: розовая - 0,05%, синяя - 0,1%, черная - 0,2%, коричневая - 0,25% и зеленая - 0,3%ТФУ. Для более удобного сравнения произведена нормализация всех хроматограмм по сигналу.

На рисунке 1 представлен результат сравнения полученных результатов. Хорошо видно, что по мере увеличения концентрации ТФУ увеличивается время удерживания основного пика, так и разрешение между пиками примесных белков. Особенно хорошо увеличение разрешение проиллюстрированно на рис. 2 и 3, где нормализация была проведена по главному пику.

Рис. 2 Сравнение хроматограмм разделения тестовой смеси белков при различных концентрациях ТФУ: зеленая - 0,05%, розовая - 0,1%, синяя - 0,2%, черная - 0,25% и коричневая - 0,3%ТФУ. Для более удобного сравнения произведена нормализация всех хроматограмм по пику основного вещества.

Рис. 3 Увеличение фрагмента рис.2

Как особенно хорошо видно на рисунке 3 при минимальных концентрациях трифторуксусной кислоты практически не наблюдается примесных пиков, а при увеличении концентрации ТФУ - пики начинают появляться, причем с достаточно приличным разрешением друг от друга. Наиболее наглядно появление пика с права от основного. Но и слева отчетливо видно постепенное "отставание" примеси от пика главного вещества: на зеленой хроматограмме (0,05%ТФУ) он отступает менее чем на 0,5 минуты от основного пика, а затем постепенно "отползает" аж до 1,5 минут на "коричневой" хроматограмме (0,3% ТФУ).

Единственное замечание: ТФУ очень сильная кислота, так что необходимо контролировать pH, чтобы не посадить колонку, но концентрация 0,2% ТФУ обычно нормально переносится колонкой.

 

 

О пользователе

Василий's picture
User offline. Last seen 16 weeks 1 day ago. Offline
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Joined: 20/05/2009