Особенности упаковки FPLC колонок на примере колонок серий ХК и HiScale

В настоящее время при разработке технологий и пилотном производстве фармпрепаратов на основе белков активно используется технология FPLC, основанная на использовании сорбентов, матрица, которых состоит из сверхсшитых полимеров природного или искусственного происхождения. Данные сорбенты за счет своей относительно жесткой и ажурной структуры создают очень низкое сопротивление даже вязким белковым растворам при высоких (зачастую более 300 см/час) и обладают очень высокой емкостью (от 20 до 100 и более мг белка/мл сорбента). В то же время зачастую максимальное давление для данных сорбентов лежит, зачастую, в пределах 3 атмосфер. Таким образом для использования всего потенциала сорбентов данного типа достаточно колонок, позволяющих удерживать сорбент с размерами частиц не более 30 мкм, выдерживающих давление 3 атмосферы, а также легко и воспроизводимо перепаковывающихся. Стандартом де-факто данного типа хроматографических колонок являются пустые колонки (empty columns), производимые в настоящее время фирмой General Electric, серри XK (XK columns). Относительно недавно та же фирма представила новую серию FPLC колонок, позволяющих работать под более высокими давлениями (HiScale columns). Также довольно распространены FPLC колонки фирмы Kronlab серий Eco и EcoPlus, несколько отличающиеся от продукции General Electric, но по большому счету конструкционно все эти колонки очень близки, так как состоят из тела колонки и подвижного и неподвижного адапторов. Так вот,  не смотря на простоту данных колонок для всех них существует общее место, зачастую, вызывающее сложности при работе: воспроизводимая упаковка (переупаковка) колонки. Целью воспроизводимости упаковки, в общем смысле, является получение колонки, упакованной требуемым количеством сорбента, с требуемой эффективностью. Для достижения цели необходимо использовать стандартную процедуру упаковки FPLC колонок, учитывая некоторые тонкости, которые я хочу объяснить, опираясь на видео представленные на Youtube.

К моему сожалению на этом видео-хостинге удручающе мало толковых видеоклипов по хроматографии, а по упаковкам FPLC колонок я смог найти только 3, не один из которых не может, по моему мнению, полностью расрыть проблему упаковки колонок для FPLC. Поэтому будем рассматривать все 3 видеоклипа, в каждом из которых есть важные моменты, не представленные в других. Но сначала для более осмысленного анализа при просмотре необходимо определить возможные проблемы достижения поставленной цели. Как уже говорилось нам необходимо упаковать колонку, со следующими характеристиками:
1. Определенного объема;
2. Высокой производительности;
3. Паспортной эффективности и качества упаковки.

Объем колонки, в нашем случае, приравнивается к необходимому объему сорбента, упакованного в колонке. C учетом того, что сорбенты, зачастую:
а) представлены в виде суспензии, и
б) относительно легко, но обратимо сжимаемы, под давлением потока (т.н. "усадка" сорбента) - необходимо предварительно произвести дополнительные исследования, для определения содержания сорбента в суспензии, а также стапени его "сжимаемости" или усадку.

Следующая характеристика, высокая производительность, определяется как способность создавать минимальное сопротивлению потоку. В связи с тем, что ни в одном из видео в явном виде и не объяснено, как достигается данное требование, то скажу сразу, что перед упаковкой сорбент необходимо подвергнуть процедуре декантации для удаления мелких частиц, присутствующих в сорбенте и вызывающих избыточное, относительно паспортного, сопротивление потока. Обычно достаточно провести процедуру 2-3 раза, чтобы удалить большую часть мелких частиц сорбента, тем самым достигнув паспортной производительности (сопротивления потоку) сорбента и монодисперсности.

Требования к эффективности и качеству упаковки, зачастую приведены в паспорте к упаковываемому сорбенту и ограничиваются определением высоты, эквивалентной теоретической тарелки Н, которая для данного типа сорбентов должна укладываться в 0,2-0,5 мм и коэффициента асимметрии Аs. Оба эти параметра легко определяются проведением ацетонового, или иного, теста на уже набитой колонке и должны быть в следующих пределах: 0,2мм<Н<0,5мм и 0,8<Аs<1,4. Как хорошо известно из теории хроматографии высота теоретической тарелки напрямую зависит от однородности набивки сорбента. В предыдущем абзаце мы описали процедуру декантации, которая улучшает однородность упаковки, но существует еще одна, не указанная ни в одном из приведенных клипов процедура: дегазация. Данную процедуру очень желательно проводить  как с суспензией сорбента (исключительно под вакуумом!), и, особенно, с растворами в присутствии которых будет проводиться упаковка, т.к. мельчайшие пузыри воздуха, возникающие как в слое сорбента, так и в тракте хроматографа могут значительно воспрепятствовать успешной упаковке хроматографической колонке.

Вводная часть закончилась теперь перейдем к просмотру и обсуждению. Наиболее толковым из представленных видео является видео 1, на котором показано, как упаковывать колонки новой серии GE - HiScale. Его мы и будем в осносном обсуждать, а к другим обращаться по мере надобности.

Видео 1. Упаковка колонки HiScale.

 Видео 2. Упаковка колонки XK 26/40 специалистом фирмы Tosoh

  Видео 3. Упаковка колонки XK 26/20

 1. В начале нам показывают какие принадлежности нам необходимы для успешной упаковки, там все правильно, кроме того, чтоя бы взял 2 шприца, а ключи нужны только для упаковки колонок данного типа. Также тут показано, что упаковочный буфер состоит из раствора 0,4М NaCl в 20% этаноле, скорее всего этот раствор выбран для удаления остаточных неспецифических взаимодействий между гранулами белка и материалом колонки,но я в этом необходимости не вижу и всегда упаковывал, используя очищенную дегазированную воду.

2. Далее девушка осматривает колонку и разбирает-собирает адапторы.

Это тоже правильно, лучше все сделать своими руками, а не думать, что там "все нормально".

3. Соединяет колонку с упаковочным резервуаром и устанавливает в держатель.

Упаковочный резервуар необходим только когда объем сорбента больше 1/2 колонки. Это связано с тем, что при упаковке используется 50-60% суспензия сорбента.

4. Очень ловко заполняет нижний адаптер 20% этанолом при помощи шприца.

Почему ловко? Все дело в том, что это одна из основных и важных процедур: под сеткой не должно остаться ни каких пузырьков воздуха (для равномерного распределения потока и недопущения образования застойных зон), ососбенно это критично для верхнего адаптора. Так вот я (да и все, с кем я общался) всегда для этих целей использую только дистиллированную воду и чтобы ею заполнить адаптер через шприц необходимо, чтобы изначально все поверхности адаптера были очень чистые и сухие (особенно это касается сетки). Иногда получается, а иногда пузырь остается и переделываешь, особенно трудно так заполнить адаптер большого ( 50 и более мм) диаметра. Поэтому я поступаю по другому: снимаю сетку, заполняю трубки адаптера с помощью шприца и не снимая шприца опускаю адаптер в емкость с водой и уже там, в полностью погруженном состоянии, под водой надеваю сетку. Не очень удобно, но успех гарантирован с первого раза.

5. Устанавливает нижний адаптер в колонку и заполняет нададаптерное пространство колонки жидкостью.

6. Снимает шприц и заглушает колонку.

Не делайте этого ни в коем случае! О причине ниже.

7. Перемешивает и заливает суспензию сорбента в колонку.

Тут несколько важных вопросов:

  • Как, исходя из нужного объема сорбента в колонке, перейти к объему суспензии сорбента?
  • Как перемешивать суспензию сорбента?
  • Как правильно заливать суспензию сорбента в колонку?

Первый из вопросов очень подробно описан во 2 видео на 3мин и 10 сек. Кратко поясню, что объем сорбента определяется заранее при помощи мерного цилиндра, причем объем отстоявшегося (седиментированного) сорбента в цилиндре должен быть в К раз больше, чем требуемый объем сорбента в колонке (там он 90,3 мл), где К=коэффициент сжатия (compression factor) для данного сорбента (приводится в описании сорбента). После того, как объем сорбента был определен и отмерен объем суспензии получают делением объема сорбента на концентрацию суспензии, которая обычно 50-60% (во 2 клипе 63%). Недостающий объем добавляют и перемешивают. И только после этого дегазируют под вакуумом (50-100 mBar при  аккуратном покачивании и простукивании емкости ).

Перемешивание суспензии также важный процесс. Частицы сорбента достаточно хрупкие, а суспензия досточно густая (легко захватывает пузырьки воздуха), так что перемешивать лучше пластиковой палочкой, не касаясь стенок и дна (иначе опять придется декантировать от разрушенных гранул) интнсивно, но не создавая бурунов, чтобы не захватить воздух.

Как не странно на третий вопрос наиболее точно отвечает 3 клип, где суспензию добавляют по палочке, прислоненной к внутренней стороне колонки, в вертикально установленную колонку, а в первых 2 просто льют сверху. Тут самое главное - не нахватать пузырей при заливке, поэтому поток должен быть наиболее ламинарный, хотя и интенсивный иначе суспензия начнет оседать раньше, чем весь сорбент попадет в колонку. Поэтому другое важное условие заливки суспензии: заливать необходимо сразу после перемешивания. Поэтому чаще всего в такие длинные и узкие колонки я заливаю суспензию немного наклонив их по стенке, после чего сразу возвращаю в вертикальное положение, тут же доливаю до верха воды и перемешиваю длинной палочкой прямо в колонке. С толстыми колонками легче: их даже наклонять не нужно и так все прекрасно льется по стенке.

8. Заполняет колонку до верха (с горкой) и вставляет заполненный при помощи шприца верхний адаптер под углом к поверхности жидкости в колонке.

Тут все верно (как в 1 так и в 3 клипе): для недопущения образования пузырей под адаптером именно так его надо (под углом) вставлять. Для подстраховки можно налить воды полную юбку держателя адаптора: избежать пузырей будет проще, но воды много натечет на стол, или после того как вставлен аддаптер удалить лишнюю жидкость пипеткой (клип 3). В противоречии с данным способом представитель Tosoh на видео 2 творит сущее безобразие: вставляет адаптер в незаполненную колонку, опуская адаптер в суспензию, после чего немного подергав "удаляет пузыри". Ни чего подобного: так выгнать их если и получается, то очень редко, а при использовании колонки большого диаметра так никогда. У него не получилось: если внимательно и на полном экране посмотреть видео, то по бокам от блика на колонке видны 2 пузырька под адаптером (с 7 минуты), а на 7 мин. 22 с, когда он закрывает бликующий свет их видно четко, правда долю секунды. Так что не экспериментируйте и вставляете адаптер "в воду".

9. Отсоединяет шприц, подключает колонку к хроматографу, открывает нижний выход с колонки и начинает "усаживать" сорбент пропуская раствор через колонку.

Тут тоже несколько тонких моментов:

а) Соединять выходной патрубок с колонки и хроматограф надо "капля в каплю" (drop-to-drop), что бы не в ни в коем случае не образовалось пузырей. Там и в видео 3 так и показано, но главный вопрос, который у меня возникает: откуда появилась капля на выходе из колонки? Если бы они не удаляли шприцс нижнего адаптора, то вопросов бы не возникла: чуть поддавил и капля появляется и все нормально, а тут какая-то фантастика, можно, конечно, не до конца затянув плунжнр немног прокрутить его и тем самым выдавить немного жидкости, но это неудобно и ненадежно: вам надо будет ПОСТОЯННО удерживая под напряжением плунжер одной рукой (если отпустите плунжер он тут же самортизирует и наберет воздух), другой рукой как-то соединять два шланга. Со шприцом все намного проще, так что не "экономьте" и используйте обязательно 2 шприца. Скажу больше: на колонке при упаковке и после обязательно должен быть шприц, заполненный где-то на треть или на половину упаковочным раствором. Снимать его следует только ПОСЛЕ того, как вы пускаете через колонку поток. Желательно, чтобы шприц был подпружинен: у GE есть замечательная, но дороговатая штука shipping/storage devices - это такой шприц с подпружиненным поршенм, но вполне можно обойтись и обычным пластиковым шприцем с переходником на фиттинг.

б) В представленном видео клипе к моменту осаждения сорбента потоком уже произошла частичная седиментация, а на видео 2 этого не допускают и осаждают сразу же, добиваясь, чтобы как можно полно осаждение происходило под потоком. Вообщем-то и там и там специалисты высококласные, сертифицированные можно сказать, но однозначного ответа как видете не существует. Я, например, набиваю то так, то этак, ориентируясь на свое удобство, и большой разницы не вижу, но вот, например в фирме Kronlab наставивают именно на 2 способе осаждения сорбента, аппелируя к результатам своих исследований. И у них получается, что "промедление смерти подобно": чем дольше времени происходит стадия осаждения, т.е. чем больше сорбента осадится под своим собственным весом, тем хуже будет эффективность, причем значительно. Так что вот.

в) Упаковка колонка очень ответсвенное и важное занятие, поэтому, в идеале, вам необходимо полностью отрешиться от всей суеты в лаборатории и ни на что не отвлекясь заниматься только ей, но всякое бывает. И вот вы уже 5 (10) раз за этот день раз перенабиваете колонку (и такое бывает, причем не так уж редко, один раз я колонку не мог упаковать месяца 2), ночь и вы как дурак, один во всей лаборатории, в очередной раз осаждаете сорбент постоянно бегая из холодной комнаты к компу и обратно забываете малость: снять заглушку с выхода колонки и запускаете насос, причем на не маленькой скорости... Вообщем там везде правильно люди в очках работают, очнь правильно! Колонки, скажу я вам, могут взрываться как гранаты, т.к. ни какой предел по давлению не успевает срабатывать и колонка в дребезги, только борсиликатное стекло из стен торчит: гидроудар в размере 100 бар это вам не шутка. С показанными колонками не все так трагично будет, т.к. во-первых там есть охлаждающая пластиковая рубашка, а во-вторых, там первым делом выламывается крепеж адаптера (позиция 14 на схеме колонки) и он "спокойно" вылезает из колонки вместе с крепежом. У меня такое один раз было, когда выходной шланг был уже старый, помятый, но длинный и он просто сложился в приемной емкости.

Вообщем рекомендация: не заглушайте колонку наглухо, а используйте шприц, уж если вы дажет его забудете, хотя он большой, то поршень его просто вылетет и все будет нормально.

г) В видео 2 специалист из Tosoh советует усаживать сорбент при очень высокой скорости, достигая давления на колонке 2 бар.  Очень дельное замечание, но не стоит забывать про то, что сам тракт хроматографа создает давление, а оно мериется на датчике смесительной камеры, находящейся сразу после насосов. Так чо для чистоты эксперимента иногда следует подключать колонку, особенно большого объема, где используются очень большие потоки (например, до 100 мл/мин при упаковке XK 50) не к колоночному клапану, а непосредственно к смесителю, иначе вам придется делать дополнительные манипуляции для определения давления именно на колонке. Вообще условия упаковки и усадки сорбента должны быть прописаны, так, например для сорбента  Capto MMC (GEhealthcare) указаны совершенно сумасшедшие потоки: при упаковке колонки Tricorn 5/100 (5 мм. диам на 10 см длины) компания советует устанавливать 13 мл/мин!!! это, если не ошибаюсь, 3972 см*час.

 10. Отмеряет и отмечает уровень сорбента, отсоединяет колонку от хроматографа, снимает упаковочный резервуар и опять вставляет адаптер.

Опять же есть тонкости:

а) из видео я не понял, но по моему уровень сорбента измеряют при выключенном потоке, что правильно, однако следует учитывать, что сорбенты, упаковываемые в колонки данного типа достаточно упругие и довольно сильно "просаживаются" под потоком, а с другой стороны представляют собой достаточно плотный гель в набитом состоянии, который "расправляется" далеко не сразу, так что остановили поток, подождите минуты 2-3 в зависимости от высоты слоя сорбента (чем выше - тем дольше). При правильном подходе мы определяем объем сорбента, большего в К (compression factor) раз, чем требуемый объем колонки. Достаточно часто именно на этом этапе оказывается, что сорбента больше/меньше, чем требуется. Если различия критично, то необходимо выбивать колонку (тут нам помогает видео клип 3), добавлять/отбирать необходимый объем суспензии и начинать все заново. При этом очень советую все очень тщательно вымыть и разобрать/собрать адаптеры. Иногда, когда слой сорбента мал относительно высоты колонки и у вас есть подходящая палочка (пипетка, например), то можно полностью процедуру не повторять, а вынув верхний адаптер заполнить колонку до верха водой или упаковочным раствором и прямо в колонке все аккуратно перемешать до состаяния суспензии не задевая дно - сетку адаптера, а то порвется.  После этого добавить/отобрать неоходимый объем суспензии и снова производить осадку сорбента.

б) верхний адаптер совсем не обязательно отсоединять от хроматографа и тогда не надо будет опять его заполнять.

в) колонку лучше не наклонять во время упаковке: так что подставте под колонку тазик и откручивайте упаковочный котейнер, что прольется - вытрете, или используйте перестальтический насос.

11. Осаживает адаптер до поверхности сорбента, пускает поток и потом осаживает адаптер дорассчетанного при помощи compressing factor уровня при помощи ключей.

Ключи это специфика колонок Hiscale, а с XK column приходиться крутить ручками. Причем смею полдвергнуть сомнению подход применяемый специалисткой из GE, т.к. вот так уминать сорбент адаптером до нужного предела может привести, по моему мнению, к переуплотнению верхнего слоя.

Это самый трудный как в физическом, так и в исполнительском плане процесс при упаковке, так что лучше это делать мужчинам (XK 50 исключительно) и в строительных перчатках "с пупырышками", особенно если вы упаковываете колонки XK 50. Объясняю почему: наша цель - после того как сорбент просел под потоком (скорость, обычно берется на 30-50% выше рабочей) необходимо как можно быстрее передвинуть адаптер к той точке колонке, до которой опустился сорбент и немного погрузить в сорбент его поверхность. На видео 2 советуют на 2 мм, но на практике их ни кто не мерил и опускают до резинового уплотнителя. Во всех видео советуют остановить поток, а потом уже опускать адаптор при заглушенном нижнем адаптере, отдельно напоминая (особенно во 2 видео), что излишки жидкости должны выходить через верхний адаптер, но ни как не через слой сорбента. Это объясняется следуюшим: при окончательной усадке адаптера его ослабляют ровно настолько, чтобы он мог двигаться внутри колонки, но поток шел исключительно через какнал адаптера. В результате резиновый уплотнитель остается достаточно сильно прижат к стенкам колонки, что приводит к значительным усилиям прилагаемым при прокручивании адаптера. Вращение адаптера при этой процедуре трудно провести плавно, не останавливаясь (если только в 4 руки) в результате происходит потоянные сотановки, а, следовательно, и пульсации потока, которые проходя через сорбент могут нарушить его равномерность, а при заглушкенном нижнем адаптере поток через сорбент не идет.

Так вот эту процедуру (усадки адаптера в сорбент на заданном участке) обязательно необходимо провести за один раз, иначе, если вы ввели адаптер в слой сорбента, а затем, после пуска потока у вас сорбент опять просел, то неминуемо нарушится его верхняя поверхность, что сильно снижает качество упаковки.

Обычно это делается так:

  • Адаптер свободно опускается почти до поверхности (1-2 мм допуска) сорбента, закручивается и запускается поток.
  • Сорбент просел до необходимого уровня, после чего поток пропускается еще 10-20 минут.
  • Поток останавливается, быстро заглушается нижний выход шприцом (на выходе давления практически не будет и шприца достаточно, чтобы не давать выходить жидкости), ослабляется винт на адаптере, адаптер отсоединяется от хроматографа и как можно быстрее крутя адаптер опускаем навстречу расправляющемуся сорбенту.
  • Как только расстояние между сорбентом и адаптером становится критическим (1-3 мм) соединяем верхний адаптер с хроматографом, затягиваем адаптер и пускаем поток, опять осаживая не коснувшийся адаптера сорбент.
  • Повторяем эти процедуры пока слой сорбента в "сжатом" состоянии был на расстоянии не более 2 мм от адаптера и последний раз докручиваем адаптер уже опуская его в слой сорбента и последний раз прогоняя через нее упаковочный раствор уже минут 30-40. Все колонка упакована.

В принципе мы иногда нарушали и осаживали адаптер не отсоединяя от хроматографа при открытом нижнем адаптере, но в 4 руки (один человек крутит тело колонки,а другой - адаптер, в результате чего получается почти плавно) и качество упаковки было приемлимым.

Вообщем, в результате описанной процедуры можно получить колонку заданного объема, по качеству упаковки которую, можно сравнить с преднабитыми колонками HiLoad column от GE. Ее даже можно (но все таки не желательно)  храненить на боку.

12. В конце процесса, почему-то показывается колонка сос свободным объемом над сорбентом, этого я не поял совсем.

13. Тестирование качества набивки проводится стандартным методом ацетонового теста: 1-2% объема колонки 1-2% ацетона. Все понятно объясняется в видео 2. По характеристикам пика определяется ВЭТТ и ассиметрия пика стандартными методами.

14. Замена колонки и ее хранение.

Как я уже говорил самое важное это шприц:). Ни когда не делайте так, как показываю на видео 2 и 3: там колонку просто отсоединяют от хроматографа.Ппри этом СРАЗУ самотеком у вас вытечет пусть и не большая, но очень значительная капля, освободив место пузырю. Затем они колонку затыкают заглушками, как обычную ВЭЖХ колонку и кладут. Смею уверить, что ни чего абсолютного в мире не существует, так что протечки, пусть и небольшие, но будут и, в результате, через очень непродолжительное время колонка засохнет.

Так что снимать набитую FPLC колонку, которая еще пригодиться, надо так:

  • Отсоединяете нижний адаптер от хроматографа
  • Присоединяете к выходу с колонки пустой шприц
  • Запускаете поток консервирующего раствора до тех пор, пока шприц не заполнится на 1/3-1/2
  • Останавливаете поток.
  • Отсоединяете верхний адаптер от колонки и заглушаете его.

Все. Всем удачи. 

Прикрепленный файлРазмер
Устройство колонки ХК.PNG76.09 кб

О пользователе

Василий аватар
User offline. Last seen 8 недель 4 дня ago. Не в сети
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Зарегистрирован(а): 20/05/2009