Использование детектора проводимости при детектировании пика белка

Часто получается так, что в подвижных фазах, используемых при хроматографии белков необходимо использовать компоненты поглощающие на длине волны детектирования. Это терпимо в том случае, когда концентрация данного компонента в подвижной фазе постоянна на всем протяжении хроматографии: в результате уровень поглощения данного компонента не меняется и может быть принят за уровень базовой линии, но совсем другая картина получается если его концентрация меняется с течением времени, например, при градиентном элюировани. В данном случае хроматографический пик элюируемого вещества "размывается" и его границы трудно определимы, что создает значительные трудности по его сбору и идентификации.

С таким случаем я столкнулся при проведении Ni-хелатной хроматографии одного белка. Как известно при данном виде хроматографии элюция происходит или понижением pH, или при помощи имидазола. Так вот, последний раз я занимался хелатной хроматографией лет 8 назад и немного подзабыл что там, да как. Вообщем освежил память при помощи книг и приступил:

Промыл колонку, "зарядил" ее Ni, промыл водой и уравновешивающим буфером, нанес белок, опять промыл уравновешивающим буфером и промыл буфером для смыва "неспецифики" и приступил к элюции градиентом имидазола. Детекцию проводил на 280 нМ. Пик вышел, какой-то странной формы ( см. темно синяя линия на рисунке 1),

Рисунок 1. Общий вид Ni-хелатной хроматографии белка при использовании элюции имидазолом.

т.к. выхода на базовую не произошло, а после небольшого спада оптика продолжила "ползти" в верх. Делать не чего: собирал все во фракции до тех пор пока оптика не выровнялась при достижении максимальной концентрации имидазола при которой гарантированно все с Ni должно было сойти.

Теперь встала проблема определить в каких фракциях все-таки вышел белок. Это необходимо для снижения количества анализов (в противном случае ВСЕ фракции необходимо отдавать на анализ, что расточительно и занимает много времени) и определения оптимальной концентрации имидазола, необходимой для элюции данного белка. Данную проблему я решил обратив внимание на показания детектора проводимости. Данный детектор регистрирует изменение проводимости подвижной фазы и установлен в подавляющем большинстве современных (и не очень) препаративных хроматографах. Так вот известно, что при прохождениии белка через ячейку кондуктивности практически всегда происходит снижение сигнала данного детектора из-за того, что большие молекулы белка снижают подвижность низкомолекулярных ионов, в основонм отвечающих за проводимость. Как видно из рисунка 2 детектор проводимости, в отличии от UV-детектора, "нарисовал" пик правильной , пусть и зеркальной, формы. Таким образом стало ясно, что пик ограничен во фракциях 1-6, при этом часть пика белка "потеряна", т.к. хорошо видно, что сбор фракций начался позже, чем началась элюция белка. Так что в следующий раз сбор фракций буду проводить с самого начала градиента.

Рисунок 2

Да, следует заметить, что некоторую сумятицу в мою голову внесли книги, по которым я "освежал" знания по данному виду хроматографии. Так в данных книгах, в частности "Protein purification appl." от Амершам, ни слова не сказано о том, что имидазол поглощает пр 280 нМ и даже хроматограммы, приведенные там показывают, что изменения оптической плотности при увеличении концентрации имидазола не происходит. В результате я немного был растерян во время того, как пик не вышел на базу и рост оптики продолжался. Просто я совсем забыл, что имидазо- циклическое, гетероатомное органическое соединение с ароматическими свойствами, все данные соединения прекрасно поглощают при 280 нМ.

Так что книги надо читать разные, а не только по хроматографии:).

Всем удачи!


О пользователе

Василий's picture
User offline. Last seen 25 weeks 1 day ago. Offline
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Joined: 20/05/2009