Удивительное стечение обстоятельств или как два хроматографиста со стажем напрочь угробили хорошую ВЭЖХ колонку

Однажды был какой-то на удивление дурацкий день: у меня 2 раза в моем присутствии при фильтрации забивался фильтр и мигом его срывало к чертовой матери, в результате чего ренатурат капал даже с потолка, еще у одного здорового парня вдруг кровь пошла носом ну и так по мелочи. А еще у одного хроматографиста метод, который он перенес уже на десяток с лишним хроматографов, по непонятным причинам ни как не хотел воспроизводиться на очередном ВЭЖХ-хроматографе. Принципиальная конфигурация хроматографической системы такова: колонка-С18, фаза А-20% ацетонитрила в воде, фаза Б-80% ацетонитрила в воде. Градиентная элюция со стартом на 28% и до 60% В, затем уравновешивание (Рис. 1).

Рисунок 1. Хроматограмма стандарта, полученная при правильно работающем методе.

При потоке 1 мл/мин на старте давление в норме порядка 110 бар (Рис. 2).

Рисунок 2. Изменение давления во время градиента ацетонитрила в водной фазе.

Так вот пошел товарищ с данной колонкой и фазами ставить метод на другой хроматограф. Все прикрутили, уравновешивают-давление выше 90 не поднимается. Ну ладно, вдруг давление в системе низкое, вкололи пробу - все свалилось в мертвом объеме. Повторили (ну первый вкол не в счет)- та же картина. Непоняяятно. Но выход был быстро найден, т.к. у него в лаборатории в это же время хроматограф был настроен под тот же метод, но был в ожидании проб. Так что он быстренько сходил, снял колонку и фазы и уже с ними, отработанными и проверенными пошел опять. Опять все прикрутили, запустили та же хрень-все опять вывалилось в мертвом объеме, хотя так и не бывает. Как оказывается еще и не так бывает. Значит несолоно хлебавши собрал он свои пожитки и думая плохое про хозяина этого загадочного хроматографа пошел к себе.  Прикрутил на прежнее место колонку, поставил на место фазы и тут я со своими пробами как раз подоспел. Я ставлю пробу а он мне рассказывает что "вот тут работает, везде работает а вот ТАМ... почему то ни хрена и еще давление почему-то очень низкое". И тут мы лицезренеем картину маслом: низкое давлени и все тоже сваливается в мертвом объеме (Рис. 3).

Рисунок 3. Хроматограмма результата анализа во время которого материал элюировался в мертвом объеме.

 Немая сцена: хроматораф заразился, через колонку подхватил заразу!!! Вообщем уже дружно жмем плечами и начинаем уже вместе плохое про того хроматографиста думать. Как оказалось у него там куча всяких ручных и автоматических клапанов-разветвителей для выбора растворов и прочего: скорее всего, думаем, перепутал что-нибудь там в своих дебрях, да и пустил на колоночки наши щелочь, чем их успешно и угробил. Ну действительно, получается, что после установки в тот хроматограф сопротивление потоку резко упало, а аналит не держится: типичная картина для "лысой" обращенной фазы. Делать нечего-достаем НЗ: последнюю, интактную C18 и устанавливаем ее в хроматограф. Пока она уравновешивалась мы заскучали и от нечего делать решили проверить: разбираются или нет аналитические ВЭЖХ-колонки - ну интересно же, да и колонки вот "мертвые", все равно на выброс. Оказывается очень даже просто разбираются, но ни чего интересного не нашли так, сорбент поковыряли, фрит попытались выдавить и все. Вторую отложили на потом, т.к. подошло время колоть первую пробу на новой колонке. Вкалываем и видим ту же картину. Мы в ступоре и поэтому даем дойти анализу до конца. И только тут замечаем (опять спасибо огромное Chromeleon), что во время градиента мы почему-то наблюдаем не обратный градиент давления как раньше (т.е. при увеличении %В в такой-же пропорции падало давление в системе из-за увеличения объемной доли ацетонитрила), а прямой, т.е. давление во время градиента росло (Рис. 4).

 Рисунок 4.

Смотрим на фазы: все шланги погружены в нужные растворы. Но давление не врет и наблюдаемая картина может получиться только если фазы А и Б перепутаны местами, поэтому вывод тут только один. Лаборантки когда готовили обе фазы просто перепутали банки и этикетки к ним. Но когда устанавливалиони не смотрели на этикетки, а просто помнили что где и поэтому установили правильно, в свою очередь, когда товарищ снимал колонки, то тоже не посмотрел на этикетки и не заметил ошибки, а устанавливал уже по этикеткам, т.е. в обратном порядке, поэтому было низкое давление и ни чего не держалось (и то и другое из-за избытка ацетонитрила). Ну и если бы не случилось в этот момент этой попытки переноса на другой хроматограф, которая всех запутала, то мы бы вместо того, чтобы кого-то обвинять быстро бы нашли причину, да и колонка за 40 т.р. была бы цела. Вообщем сделали зеркальный градиент и сразу все стало на свои места и давление и времена выхода (Рисунки 5 и 6). Вот такая история.

 Рисунок 5. Хроматограмма стандарта при использовании зеркального градиента.

 Рисунок 6. Изменение давления при использовании зеркального градиента.

Резюме ко всему этому подобрать сложно, т.к. все ошибаются, и не все возможно контролировать, но в голове почему то все время вертится "расстрелять к чертям и уволить без содержания" .  А да, все таки придумал: следите за давлением, но не только в хроматографе, но и себя не забывайте, т.к. у того парня кровь все-таки из носа тоже из-за давления пошла.

Всем крепчайшего здоровья и  прекрасных праздников!

Shurae's picture

Согласен на 200%

Согласен на 200% со словами "следите за давлением" и всем всегда рекомендую даже завести блокнотик, в который хотя бы это самое давление ежедневно писать (разумеется, вместе с упоминанием колонки и метода).

Василий's picture

Блокнотик это

Блокнотик это замечательно, только я до сих пор не пойму почему ВСЕ хроматографы показывают давление, но далеко не все позволяют его записывать.

Shurae's picture

Мне кажется,

Мне кажется, что как минимум по причине аналоговости сигналов на многих ВЭЖХ-системах. Следовательно, для записи еще одного сигнала (давления) придется ставить дополнительный канал АЦП.
Это, правда, не дает ответ на вопрос, почему не все производители, у которых сигналы в виде цифры, не заморачиваются на такой важный, полезный и удобный момент, как запись давления (или, к примеру, температуры термостата колонок). Видимо, "ломает" :)

Василий's picture

Ну да вот Varian'у

Ну да вот Varian'у (а сейчас Bruker, вроде) точно "в лом": у него все по USB. Очень хотелось бы узнать: а хоть один наш производитель хроматографов так "заморачивается"?

Shurae's picture

Пусть меня

Пусть меня поправят отлично знающие отечественное оборудование пользователи, но насколько я знаю, ответ "нет". Как раз, думается, по причине необходимости отдельного канала на АЦП. Хотя я более чем уверен, что если бы Амперсенду (производитель отечественного ПО Мультихром) поступило бы такое задание, то они бы легко его выполнили бы (понятно, что не за так).

Valeriy's picture

"Портрет" давления.

Так уже стоит АЦП! Причем у всех производителей. А иначе что мы видим, причем в разных единицах измерения. Попросите изготовителя вывести картинку (положить цифру на время) и вот вам график. Только это попросить в копеечку встанет. Амперсенд тоже не промах в этом плане. Если бейсик хорошо знаете, то и самим можна.:)) На плату в насосы нужно залезть, только и всего!:))

Василий's picture

А вот из

А вот из непроверенных источников я слышал, что Dionex основные деньги как раз не за оборудование, а за свой могучий Chromeleon получает. Так может Амперсенду самому как-нибудь чуть поднапрячься, а не сидеть на своих непонятно откуда взявшихся и, скорее всего, очень шатких лаврах и сделать, наконец, нормально работающую систему которая все что позволяет оборудование будет контролировать. Я думаю многие бы за разумные деньги со всяких без(д)умных Galaxie и т.д. на нормальное русскоязычное ПО перешли.

Valeriy's picture

Деньги за ПО.

Ну ты сравнил, Василий, Амперсенд с Dionex. Первый ДВК пришпандорили к Милихрому, если не ошибаюсь, году эдак в 1987-88. До этого были в лучшем случае интеграторы. В это самое время Петя Схунмакрс уже написал и издал (ее соизволили перевести в 89 г) свою "Оптимизацию селективности..." Эта книжка, на мой взгляд конечно, описала основы того самого Хромелеона, который мы наблюдаем сегодня не без Васиной помощи. А у нас за это время успели только разломать развитой коммунизм и построить развитой капитализм. Заниматься разработкой ПО было просто некогда.
До Гелакси был Стар. Хороший пакет. Намного удобнее чем Гелакси, и не такой неповоротливый. Такая мысль закралась: может Гелакси сгубила Вариан?
Я сейчас пользуюсь NetChrom под Кристаллюкс 4000М (программирование газа-носителя по давлению отображается в отдельном окне). Нормальное ПО, мне нравится. Если бы Метахром собирал бы жидкостники, NetChrom выглядел бы очень даже ничего.
Относительно стоимости ПО, предназначенного для узкоспецифичного оборудования, коим является хроматография. Мне вообще не понятно за что берутся деньги. В прошлом году за него заплатили 17000 рублей. Деньги конечно не большие, но мое мнение: это ПО должно быть бесплатным. Оно не является средством разработки, и не имеет никого смысла без прибора, причем без именно этого.

Shurae's picture

Позволю себе

Позволю себе не согласиться с последним постулатом.
БОльшая часть современного ПО, что Chromeleon, что EZChrom, что многие другие хроматографические пакеты как раз изначально создавались для работы в так называемом мультивендерном варианте, то есть с хроматографическими системами не только своей фирмы, но и многих других. Для того же Chromela "протоколируется" свыше 300 приборов от более 30 производителей, для EZChrom 330 модулей от 25 производителей.
Так что тут явно есть за что бороться, а не сдавать все занахаляву :)

Василий's picture

Я тоже об этом слышал

Я тоже об этом слышал, от этих самых производителей зарубежного ПО на всяких хвалебных презентациях (в том числе и Dionex), но видимо специфика их работы в нашей стране такова, что у нас это как раз только красивые слова и как только заходит речь о чем-то подобном, то сразу возникают какие-то жутко непреодолимые "трудности", типа: "у Вас такой редкий(старый/новый/китайский) контроллер(шнур USB/подставка под бутыли), так что лучше купите у нас цельный хроматограф".
Поэтому я думаю, что в данном случае появление именно на нашем рынке нормального, полноценного, к тому же русифицированного ПО для ЖХ было бы очень востребовано.

Shurae's picture

Да, специфика

Да, специфика российского рынка она всегда выползает. Да и смысл переводить все приборы от разных производителей на единую программную платформу ИМХО имеет смысл либо когда пользователю(ям) особенно нравится какой-то один софт или когда приборов не менее 10. Видимо, в силу своей неосведомленности второй случай я пока не встречал. А первый случай видел пару раз. Один из них, когда человек, который успешно работал на 3 Dionex-ах, хотел заставить работать в человеческом режиме (а не на самописце или интеграторе) еще и старенький HP1050 и Breeze, что и было успешно полощено в жизнь :)

Ну а полноценное мультивендерное русифицированное ПО - вещь классная. Его (мультихром) вам слепят на том же Амперсенде, включая и управление модулями. Только снова встает вопрос - насколько корректно он будет управлять (простые-то приборы управляются легко, а вот стоит чуть "копнуть" вглубь - увы) и насколько в лучшую сторону он будет по цене отличаться от англоязычного оригинала (скорее всего незначительно, учитывая опыт получения даже минимального управляющего модуля).

Геннадий's picture

Настоящий

Настоящий хроматографист делает подвижные фазы сам, а не заставляет лаборанток. Так можно и растворы готовить их заставить, а что делать хроматографисту? Пялиться в экран?
Вообще, случай не заслуживает публикации. Мало ли чего бывает.

Василий's picture

Интересная

Интересная точка зрения:)
Геннадий напишите, пожалуйста, что-нибудь что, по Вашему мнению, имеет ценность для публикации. Было бы очень интересно.

Виктор's picture

Заверните мне настоящего хроматографиста и пришлите по цене лаб

Во блин дожили- такие ляпы звучат на сайте. Геннадий, Вы на восемь тысяч руб. к нам хроматографистом пройдёте? Хроматографов всего штук 50 в радиусе километра. Работа естественно круглосуточная.

Геннадий's picture

Вы не можете

Вы не можете себе позволить хроматографиста? Ладно.

Геннадий's picture

Что нибудь

Что нибудь интересное достойно публикации. Таких событий, как описано в этой, много встречается. Читаешь, напрягаешься, вникаешь, в результате - обычное проишествие. Понимаешь, что зра время потратил.

Shurae's picture

Геннадий!

Думается, что если кому неинтересно читать, то совершенно необязательно о своем плохом настроении постить...

А что касается упомянутого случая, то не исключено, что для опытного хроматографиста случай может показаться и не представляющим особого интереса. Зато для начинающего специалиста, то ознакомление с таким случаем, вникание в суть проблемы и осознание того, как найти причинно-следственную связь неполадок работы, то это штука очень полезная.

О пользователе

Василий's picture
User offline. Last seen 21 weeks 4 days ago. Offline
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Joined: 20/05/2009