Тестирование аффинных сорбентов

Аффинная хроматография основана на строго специфическом взаимодействии связанных с сорбентом антител с антигеном. Благодаря этому аффинная хроматография достаточно широко применяется в биотехнологии, т.к. позволяет достаточно легко извлекать минимальные количества целевого вещества из больших объемов, зачастую очень сложных растворов. Но такая специфичность имеет и свою обратную сторону. Так если в катионообменной хроматографии в 90% случаев используют SP или CM Sepharose, то практически для любого белка можно получить несколько аффинных сорбентов с разной емкостью, специфичностью и т.д. Что, совместно с очень большой стоимости аффинных сорбентов делает задачу их тестирования очень насущной.

Обычно, первой стадией получения аффинных сорбентов является стадия получения моноклональных антител при помощи гибридомной технологии. Вторая стадия – активация матрицы (сшивка) полученными антителами при помощи химической реакции. Обе стадии имеют множество степеней свободы в результате на выходе обычно получается несколько сорбентов, свойства которых необходимо проверить. Понятно, что в целях экономии количество данных сорбентов будет очень мало, порядка нескольких миллилитров. При этом матрицы аффинных сорбентов зачастую очень плохо держат давление, что исключает использование тонких колонок, что бывало бы выходом для подавляющего числа сорбентов на основе Sepharose и Sephadex. Также проблемой при работе с аффинными сорбентами является то, что зачастую через них пропускают лишь осветленные очень богатые примесями различной природы растворы, например культуральную жидкость. Примеси могут постепенно забивать поры сорбента, увеличивая его сопротивления потока, что при использовании насоса также может привести к «схлопыванию» сорбента под действием создавшегося давления. Поэтому на стадии тестирования стараются использовать методику «gravity flow». Как понятно из названия данный способ основан на пропускании растворов через слой НФ под действием силы тяжести, что позволяет самому сорбенту регулировать поток ПФ не допуская «схлопывания». Теперь переходим к практической части.

 Дано:     по 1 мл каждой серии сорбента с заявленной емкостью 1 мг/мл; КЖ с концентрацией целевого белка 0,5 мг/мл. Как определить емкость сорбента?

 Решение:

1.       Для оценки максимальной емкости, по логике, необходимо взять избыток КЖ. – Для гарантированной оценки обычно берется двукратный избыток материала, т.е. в нашем случае надо пропустить через сорбент более 2 л. КЖ (лучше 3-4 л.).

2.    Оптимальным методом оценки, как мы выяснили, является метод «gravity flow» при максимально возможной площади нанесения (т.е. при минимальной линейной скорости потока). Как это осуществить?

 Оптимальным, по моему мнению, решением является использование Empty column PD-10 производства GE healthcare (Рис.1). Как видно из рисунка они очень похожи на корпус шприца с крышкой, только с мембраной у носика (у носика тоже есть колпачок, не показанный на рисунке).

  

 Рисунок 1 Пустая колонка Empty column PD-10

Делаем чем-нибудь острым в крышке круглое отверстие диаметром 3-5 мм. (Рис.2а)и вставляем в него обрезанный наконечник на 200 мкл (Рис.2б) как показано на рисунке 2в.

 Рисунок 2. Крышка колонки

Взвешиваем пустую колонку (m), после чего закрепляем пустую колонку на штативе как показано на рисунке 3

 Рисунок 3. Закрепленная колонка на штативе

Вносим в колонку 3-5 мл матричного буфера при открытом носике, даем немного стечь и надеваем на носик колпачок.

Обрезаем кончик наконечника на 1 мл так, чтобы диаметр отверстия составлял 2-3 мм и при помощи автоматической пипетки переносим 1,3-1,6 мл суспензии сорбента в колонку и даем сорбенту осесть.

Снимаем колпачок и даем стечь всему «суперу» не боясь засушить сорбент. Взвешиваем колонку с сорбентом (M). Плотность сорбента мы принимали за 1,1 мг/мл, поэтому объем сорбента рассчитывали по формуле V=(M-m)/1,1. Если объем сорбента недостаточен (избыточен), то той же пипеткой добавляли (отбирали) немного сорбента добиваясь необходимого объема.

При достижении необходимого объема сорбента в колонку добавляли 3-5 мл матричного буфера и взмучивали сорбент, после чего давали стечь примерно 1 мл раствора и опять закрывали носик.

Как только сорбент осаждался аккуратно заполняли матричным буфером колонку.

Соединяем наконечник, вставленный в крышку и корпус одноразового шприца на 50 мл шлангом подходящего диаметра длиной 15-30 см.

 

 Закрепляем корпус шприца на том же штативе выше колонки на длину шланга.

 

Получается вот такая капельница. Теперь постепенно наливая в корпус шприца КЖ можно спокойно прогнать весь объем за достаточно короткое время. Так 2 л. проливается примерно за 1-1,5 часа. Если скорость слишком мала, то советуют (сам не пробовал) надеть иглу от шприца на носик колнки. Не смотря на большее сопротивление потоку иголка будет "тянуть" жидкость за счет капилярного эффекта.

После того, как весь материал пройдет через сорбент, то шприцы с шлангами и крышками следует убрать и все остальные манипуляции проводить уже без них, т.к. объемы всех последующих растворов (промывок и элюирующего буфера) будут измеряться миллилитрами. Эти объемы удобнее вносить уже непосредственно в колонку, аккуратно при помощи пипетки по стеночке. Естественно, что каждый раствор надо собирать в отдельную пробирку, причем каждый раствор должен стекать до конца, чтобы как можно меньше смешивался с предыдущим.

Вот в принципе и все. Всем удачной рабочей недели.

Василий's picture

Игла

Кстати, попробовал надеть иглу (обычную инъекционную). Действительно значительно быстрее течет!

О пользователе

Василий's picture
User offline. Last seen 25 weeks 1 day ago. Offline
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Joined: 20/05/2009