Добро пожаловать


• Вход  • Регистрация
• Забыли пароль?

Обратная связь

О фирмах

Разделы

Сорбенты

Подбор состава подвижных фаз для жидкостной хроматографии: общие требования.

Для анализа/разделения любой смеси веществ возможно использовать практически бесчисленное множество систем подвижных фаз, которые в какой-то степени позволят осуществить задуманное (практически все вещества имеют какой-то заряд (пусть и частичный), какую-то гидрофобность и т.д.). Но эта «степень» будет очень сильно зависеть от выбора конкретной системы. В связи с этим необходимо как-то сузить этот диапазон, отталкиваясь от конкретных задач и условий хроматографического разделения.

Для себя я разработал несколько простых правил, которые, возможно, кому-то пригодяться:

1) необходимо выяснить растворимость анализируемой смеси в подвижных фазах: аналит должен быть растворим во все диапазоне рабочих соотношений подвижных фаз, иначе произойдет выпадение аналита в нерастворимый осадок на колонке или даже в системе (петле, патрубках и т.д.);
2) фазы должны обеспечивать как полное удержание анализируемого образца на колонке, так и его полный смыв. Т.е. хотя бы при 100% фазы А аналит должен сорбироваться на колонке, а при 100% фазы Б – гарантированно весь элюироваться. Желательно, чтобы при 100% фазы Б гарантированно элюировались вообще все сорбированные из пробы вещества, иначе колонка будет забиваться и ее необходимо будет отмывать чем-то еще;
3) подвижные фазы должны быть по возможности стабильны при используемых условиях за все время использования, т.е. не образовывать осадков, не расслаиваться и не терять свойств из-за испарения. Так, если вы готовите фазы при комнатной температуре, а используете при пониженной, то следует помнить, что при пониженной температуре растворимость солей и органических растворителей в водных растворах значительно падает. Также если вы используете в качестве одного из компонентов легко летучие компоненты, то необходимо или готовить растворы малыми объемами, расходуемыми за день-два, или герметизировать емкости (но следует помнить, что если в герметизируемом сосуде образуется низкое давления, то велика вероятность образования пузырей воздуха на входе в систему);
4) подвижные фазы должны смешиваться в любых или хотя бы рабочих соотношениях, особенно это важно при хроматографии низкого давления, т.к., например,  расслоение на органический и неорганический слои во время хроматографии не допустимо, т.к. поведение такой смеси непредсказуемо;
5) следует учитывать поток фаз и характеристики насосов при создании градиента. Так, если у вас насосы с заявленной производительностью 5000-1 mkl/min с точностью пусть даже 0,1 mkl/min (хотя, по моему опыту, это вранье) то не стоит использовать градиенты, в которых используются участки с производительностью одного из насосов в единицы микролитров, т.к. велика вероятность того, что насос (особенно поршневой) при таких потоках не доработает, а уж при небольшой разкалибровке дело будет вообще швах, и пики будут плавать непредсказуемо. Следовательно, подвижные фазы, обеспечивающие разделение в таких условиях использовать не стоит и необходимо их немного изменить.
Также положение можно исправить использование колонки более подходяшего размера. Так если вы используете колонку диаметром 2 мм, при использовании которой поток одного из насосов составляет единицы микролитров, то замените ее на колонку с большим диаметром, увеличив до той же линейной скорости поток и воспроизводимость обязательно улучшиться (пробу, елательно, тоже увеличить). Если давление позволяет, то просто увеличьте кратно общий поток.
6) следует стремиться к соотношению подвижных фаз, обеспечивающему разделение, в диапазоне 20-80% одной из фаз (20% - уравновешивание, 80% - смыв), т.к. насосы будут работать примерно в одинаковых режимах с одинаковой ошибкой. Если же это не достижимо, то следует наоборот использовать весь диапазон соотношений: 100% фазы А - уравновешивание, 100% фазы Б - смыв.

Пример: в "наследство" от предыдущего хроматографиста досталась такая система для ВЭЖХ анализа липидов: колонка Polaris C18 100×2.0 mm. Подвижная фаза А: забуференная вода; фаза Б: ацетонитрил+изопропанол+соль.  Поток: 0,2 мл/мин. Градиент (в % ф.Б): 80-80-98-98-80-80. Так вот при 98% насос А должен давать 4 мкл/мин!!!! И это при насосе ProStar210 (Varian) у котогрого даже по паспортным характеристикам поток от 5000 до 10 мкл/мин. Естетственно на этом и близлежащих участках пики плавают.
Один из возможных выходов: новая фаза А - 20% воды+ацетонитрил+изопропанол+соль; новая фаза Б - 2% воды+ацетонитрил+изопропанол+соль. Новый градиент (в % ф.Б): 0-0-100-100-0-0. Готовить фазы станет немног сложнее, но дрейфа явно будет меньше. А там поглядим, может и от этих 2% можно будет уйти.
Если что не так, пишите.
Удачи!

 

О пользователе

Василий's picture
User offline. Last seen 2 years 11 weeks ago. Offline
Администраторы



Настоящее имя Купцов Василий

Пол мужской

Дата рождения 28/01/1979

Мой сайт http://www.chromatogramma.ru/

Joined: 20/05/2009